Dipartimento di Biologia Università Roma Tre V.le Marconi, 446 I Roma I MECCANISMI D AZIONE DEI FITOESTROGENI
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1 Dipartimento di Biologia Università Roma Tre V.le Marconi, 446 I Roma I MECCANISMI D AZIONE DEI FITOESTROGENI
2 Sostanze esogene che provocano effetti dannosi alla salute negli organismi o nella loro progenie, conseguenti a cambiamenti delle funzioni endocrine Commissione Europea, 1996 ALTERAZIONE Pesticidi Prodotti di risulta Plastiche Sintesi Distribuzione Meccanismo di azione Omeostasi Metabolismo Sviluppo Riproduzione Problema evidenziato in principio dagli ecologi nelle popolazioni naturali è diventato, nell ultimo decennio, un nuovo parametro della valutazione del rischio di esposizione della popolazione all inquinamento
3 flavonoids Alcuni costituenti non nutrienti degli alimenti potrebbero possedere attività di interferenti endocrini flavonols Sono presenti in tutte le piante vascolari, ma nei mammiferi sono assunti solo con la dieta Dati ottenuti nel plasma dopo un pasto ricco di flavonoidi Isoflavoni 50 mg soia 6-8 h μmol/l Quercetina mg mele-cipolle μmol/l (flavanolo) Naringenina 200 mg succo uva 2 h 6 μmol/l (flavanone) Quali effetti?
4 Effetti Protettivi riduzione della colesterolemia, mantenimento della normale vasopermeabilità, prevenzione dei disturbi cardiaci, protezione da malattie neurodegenerative. Estrogeno-mimetici Avversi Principio antiestrogenico, presente nel trifoglio rosso, che procurava l infertilità nelle pecore in Australia. Iperplasia della ghiandola mammaria in tutti e due i sessi, spermatogenesi aberrante, cambiamenti dell utero e della vagina nei ratti esposti ai flavonoidi dal 7 giorno di gestazione fino alla vita adulta. Anti-estrogenici Effetti protettivi sull incidenza e la crescita del cancro. Prevengono l insorgenza del cancro e attivano l apoptosi in cellule di cancro Anti-estrogenici
5 A fronte degli effetti benefici questi composti sono ampiamente venduti come prodotti da banco alternativi per la prevenzione di molti effetti della menopausa Invito alla popolazione ad aumentare il consumo di cibi contenenti queste sostanze (i colori della vita) Quali i meccanismi alla base degli effetti antiproliferativi dei flavonoidi? Antiossidanti Inibitori delle Modulatori attività recettori Proossidanti chinasi estrogenici
6 Effetto della Quercetin sulla produzione di ROS Cellule prive di Cellule contenenti % variation fluorescence (H 2 O 2 vs quercetin) Quercetin concentration (μmol/l) % variation fluorescence (H 2 O 2 vs quercetin) Quercetin concentration (μmol/l) Alle concentrazioni utilizzate (1-50 μm) la Quercetina non è un pro-ossidante, ma risulta essere un potente antiossidante Galluzzo et al., Mol Nutr Food Res, 2008
7 Effetto della Quercetina sull attivazione delle chinasi P-p38 level/p38 level (arbitrary units) a' Time (min) empty Caspasi-3 PARP La quercetina attiva una cascata proapoptotica solo in presenza del recettore per gli estrogeni Galluzzo et al., Mol Nutr Food Res, 2008
8 Quali i meccanismi alla base degli effetti antiproliferativi dei flavonoidi? Proossidanti Inibitori delle chinasi Modulatori attività recettori estrogenici [Flavonoidi] 100μM [Flavonoidi] 1-10μM Antiossidanti [Flavonoidi] 50μM
9 1.2 Relative Binding log([competitor]) (M) Quercetin Relative binding [ 3 H] (nm) In presenza di flavonoidi l affinità dell estradiolo per il suo recettore diminuisce Cell number β-estradiol (μmol/l) empty 100 Cell number Quercetin (μmol/l) empty 100 Cell number Quercetin (μmol/l) 0.01μmol/l 17β-estradiol empty 100 Galluzzo et al., Mol Nutr Food Res, 2008
10 Impatto dei flavonoidi sulla trasduzione del segnale attivata dai recettori per gli estrogeni diretto indiretto Trascrizionale/genomico MISS (Membrane Initiating Steroid Signals) Effetti pleiotropici degli estrogeni
11 vitellogenina ERβ Effetti genomici diretti a pc3 promoter activity (RLU/mg protein x 10-3 ) C N Q Estrogeno mimetici μm ciclina D1 Effetti genomici indiretti pd1 promoter activity (RLU/mg protein x 10-3 ) C N Q empty ER Anti-estrogenici Estrogeno mimetici Totta et al., IUBMB Life, 2004
12 MISS Physical interactions Stimulation Cav1 membrane membrane Src G-prot p85α Shc MNAR ERK AKT Proliferazione, sopravvivenza Trascrizione indiretta p38 ERβ Cav1 membrane ERβ p38 ERβ p38 Cav1 Cav1 Cav1 membrane ERβ p38-p Apoptosi Trascrizione Acconcia et al., 2005; Galluzzo et al., 2007; Marino and Ascenzi, 2008
13 Cellule HeLa non transfettate transfettate + transfettate+ Nar Questo effetto della Naringenina non consente l associazione di con le chinasi di membrana e con proteine adattatrici Di conseguenza l attivazione delle cascate di segnale importanti per la proliferazione non avviene (Galluzzo et al., 2008)
14 La Naringenina provoca l attivazione rapida e persistente della proteina proapoptotica p38/mapk (Galluzzo et al., 2008)
15 Meccanismo in presenza di out Nar Caveole in Caveolin-1 Src PI3K p38 PAT PA MAPK AKT Bcl2 Caspasi-3 PARP AP1 ERE proliferazione apoptosi trascrizione genica diretta (Galluzzo et al., 2008)
16 ERβ Qual è l effetto della Naringenina in presenza di ERβ? In presenza di ERβ la naringenina mima gli effetti degli estrogeni attivando le stesse vie di segnale proapoptotiche comportandosi come un agonista del complesso :ERβ (Totta et al., 2004)
17 In presenza di i flavonoidi agiscono come parziali antagonisti, disaccoppiano selettivamente i meccanismi rapidi di questa isoforma di recettore: Inibitori meccanismo-specifici Quali sono gli effetti dei flavonoidi in contesti cellulari in cui non media gli effetti proliferativi di? E nei contesti cellulari in cui le due isoforme di recettore sono co-espresse? L esempio del muscolo scheletrico
18 Effetti di nei mioblasti di ratto GLUT-4 Akt SOPRAVVIVENZA ERβ P38/MAPK DIFFERENZIAMENTO MIOGENINA MHC TRASCRIZIONE (Galluzzo et al., submitted)
19 Protein level/tubulin level (arbitrary units) myoblasts time course (h) ERβ Recombinant /ERβ Tub ERβ Tub GLUT 4/tub Nar Miogenina/tub MHC/tub Nar 32kDa Caspase 3 17kDa tub Nar dose response (M) Nar (Bulzomi et al., submitted)
20 Nar +Nar P p38 tub Nar +Nar P AKT tub Nar +Nar GLUT 4 cav 1 Nar +Nar Myo tub Nar +Nar MHC tub Anche in altri contesti cellulari i flavonoidi disaccoppiano selettivamente i meccanismi rapidi di agendo come inibitori meccanismo-specifici mentre continuano ad essere agonisti di in presenza di ERβ (Bulzomi et al., submitted)
21 Flavonoidi sono interferenti endocrini Effetti estrogeno mimetici Effetti anti-estrogenici meccanismo specifici Analisi accurata Stadio fisiologico (sviluppo, menopausa) Stato patologico (rischio di insorgenza del cancro) Valutazione del rischio Test di legame ligando-recettore Affinità ormone-recettore Attività trascrizionale diretta del recettore Tutte le attività del recettore Prospettive future: analisi degli effetti e dei meccanismi di miscele di interferenti
22 Ringraziamenti Prof. Paolo Ascenzi Dr. Stefano Leone Dr. Valentina Pallottini Dr. Fabio Virgili analisi binding analisi citofluorimetrica saggio contenuto dei ROS INRAN
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24 Molecular mechanism at the root of Naringenin endocrine disrupting effects IP:anti-cav-1 IP:anti-cav-1 Tempo stimulation di stimolazione time (min) con (min) Wb: anti- Wb: anti-cav1 IP: anti - IP: anti-cav-1 Nar stimulation time con (min) Wb: anti-cav1 Wb: anti- Wb: anti- Wb: anti-cav1 Stimulation time (min) C Nar IP: anti- C Nar IP: anti Wb: anti-c-src Wb: anti-mnar Wb: anti- Wb: anti-
25 P p38 p38 tub NT si Recombinant NT si Tub ERβ tub NT si P AKT AKT tub NT si SILENZIAMENTO DI Myo tub MHC tub NT si GLUT 4 Cav 1 NT si
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