Silenziamento genico sequenza specifico. Pathway di regolazione dell'espressione genica provocato da dsrna.

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1 ( RNAi ) RNA Interference Silenziamento genico sequenza specifico. Pathway di regolazione dell'espressione genica provocato da dsrna. E un meccanismo naturale in piante, funghi, insetti e mammiferi.

2 Cronologia: 1990 espressione di transgeni in petunia causa la ( Co-suppression ) pigmentazione variegata Distruzione di RNA virali in piante: sequenze endogene sono silenziate se sono omologhe a parti del ( dsrna replicone virale (che passa da in C. elegans il dsrna porta a silenziamento genico sequenza-specifico il silenziamento genico e stato trovato in molti eucarioti, tra cui D. melanogaster, M. musculus, C, elegans, H. sapiens.

3 Ruoli noti o supposti dell RNAi Silencing di virus e sequenze ripetute Soppressione di elementi mobili in piante e C. elegans Divergenza evolutiva e speciazione in piante e invertebrati Controllo espressione genica

4 mirna nelle cellule animali: lin4 e let c. elegans sviluppo Lsy6 e mir C. elegans neurogenesi Bantem D. melanogaster-----proliferazione Mir D. melanogaster apoptosi MiR M. musculus ematopoiesi

5 Terminologia: dsrna: double stranded RNA, piu lungo di 30 nt shrna: short hairpin RNA, artificiali ma a forcina, espressi da un plasmide mirna: microrna, nt. Codificati da geni endogeni Sono precursori di forcine Possono riconosscere target perfettamente complementari (distruzione RNA=piante) o non perfettamente ( TGS=animali complememtari (blocco traduzione e\o sirna: short-interfering RNA, nt. Sia di origine esogena che endogena Derivati da dsrna Sono sequenza specifici Hanno un effetto di distruzione del mrna o inibizione traduzione

6 Classification of endogenous small RNAs

7 Inizio RNAi: un processo bifasico Generazione di sirna e mirna maturi Esecuzione (Silencing di geni target): Degradazione del messaggero inibizione della traduzione modificazione della cromatina (inibizione ( trascrizione della

8 Biogenesi mirna Trascritti da geni endogeni come primary RNA Tagliati da Drosha in pre-mirna ( 3 overang ~70nt forcina imperfetta (gia Esportati dal nucleo Tagliati da DICER in mirna maturi 21-25nt 2nt 3 overhangs, 5 P

9 Drosha Processa pri-mirna in pre-mirna taglia 3 overhangs su pre-mirna E una RNAse-III Riconosce il pri-mirna dalla forcina e dallo stelo

10 Dicer Taglia dsrna o pre-mirna Lascia delle caratteristiche 3 overhangs e 5 P e una RNAse-III Domini funzionali: (! svolgere Elicasi (deve PAZ dominio Domini RNAse-III in Tandem dsrna binding domain

11 Biogenesi mirna RNA Induced Silencing Complex ( mirnp / (RISC

12 ( RISC ) RNA Induced Silencing Complex E il complesso responsabile dell RNAi Responsabile sia della degradazione di mrna che della inibizione della traduzione Attivita del complesso: ( sirna Elicasi (svolge il ds ( mrna Endonucleasi (rompe il homology seeking /RNA binding (cerca le ( messaggeri regioni omologhe nei Incorpora preferenzialmente un solo strand del sirna Antisenso Lo riconosce attraverso AGO

13 ( Ago ) Argonauta Copurifica con RISC E la responsabile dell Homology seeking Lega sia sirna che mirna Riesce a distinguere lo strand antisenso Esistono molti AGO

14 ( RdRP ) RNA Dependent RNA Polymerase RdRP trovata in piante e C. elegans ma non in mammiferi e Drosophyla Copia uno strand e risintetizza dsrna ex novo (i sirna funzionano da primers sul ( amplifica messaggero ed il dsrna si Puo spiegare la durata del fenomeno perche e la responsabile della amplificazione dei sirna

15 Biogenesi sirna DICER taglia i dsrna in sirna 21-25nt dsrna esogeni o endogeni (virus, ( trasposoni 2nt 3 overhangs, 5 P

16 Biogenesi sirna tasirna: endogenous trans acting sirna

17 La distruzione del messaggero e la inibizione della traduzione: sirna e mirna

18 FILM!!!! From: Nature Reviews Web Focus on RNAi

19 Action mechanisms of small RNAs Small RNAs mediate gene silencing through at least four different mechanisms : endonucleolytic cleavage of the cognate mrnas translational repression transcriptional repression through the modification of DNA and/or histone DNA elimination through the modification of histone

20 Inibizione della TRADUZIONE Imperfect match tra sirna o mirna in RISC ed il target mrna RISC usualmente lega 3 UTR

21 Degradazione mrna Complementarieta perfetta tra sirna o mirna nel RISC ed il target mrna Cleavage by RISC Slicer activity

22 Trascriptional gene silencing ( TGS ) RNAi agisce anche a livello trascrizionale via modificazioni della cromatina Piante, C. elegans, Drosophyla Punti di connessione con i fenomeni citoplasmatici Argonauta e presente sia in RISC che in RIST Complesso RITS RNA-induced initiation of transcriptional silencing RITS media la formazione di eterocromatina in maniera sequenza specifica

23 la delezione di geni coinvolti nel pathway dell RNAi (AGO, Dicer, etc) impediscono il TGS di trasgeni inseriti nella eterocromatina Il silencing della eterocromatina e l RNAi sono pathways correlati

24 Modello di inibizione TRASCRIZIONALE mediato da sirna RNA omologhi alle ripetizioni centromeriche sono processati in sirna I sirna reclutano delle metilasi istoniche (tipo Clr4 ( H3 per La Lys 9 dell H3 viene metilata e il repressore Swi6 si lega e reprime ogni trascrizione

25 Ac -acetylated histones; mc-methylated Cytosine HDAC -histone deacetylases: Pol II- RNA polymerase II GTF- general transcription factors HAT -histone acetyltransferases; MBD -methylated DNA binding domain Nakao M, 2001

26 RNAi is extraordinary efficiency process Silencing effects in C. elegans can spread systemically and be passed through several generations RdRP reaction sirna- primed RdRP converts target mrnas into dsrnas which can serve as Dicer substrates that are degraded to sirnas, thereby initiating an RdRP chain reaction.

27 I sirna come tool per la modulazione della espressione genica

28 Come studiare la funzione dei geni? Gene Approccio genetico Transcript AAAA A Gene knock-out Protein -specie specifico -tanto tempo e lavoro

29 Come studiare la funzione dei geni Gene Approccio epigenetico Transcript AAAA A Protein Espressione di dominanti negativi -applicazioni molto vaste

30 Come studiare la funzione dei geni Gene Approccio epigenetico Transcript Protein AAAA A oligonucleotidi Antisenso RNA i

31 IL KNOCK-OUT FENOTIPICO: RNA o DNA antisenso ( RNAi ) RNA interfering

32 sirna vs RNA antisenso

33 RNA o DNA antisenso

34 Small RNA interference interferenza con la espressione mediata da ( sirna ) piccoli RNA di b E al momento la tecnica piu potente per l analisi della funzione delle proteine knockdown fenotipico in cellule di mammifero in coltura

35 Various strategies for RNAi in mammalian cells

36 Regole empiriche per il design di un buon sirna 21nt long, 2nt 3 overhangs Scartare introni e UTR Scartare regioni con contenuto di GC >50% Usare criteri di BLAST molto stringenti per screenare le banche dati per evitare anche mismatched annealing e inibizioni aspecifiche

37 Design razionale Mittal, 2004

38 Limitazioni dell uso del silenziamento tramite sirna sintetici ( gg Risposta transiente (~3-7 Problemi di traduzione (tipo cellulare, refrattorietà ( lipofezione alla I sirna non hanno una fonte rinnovabile di sintesi ( costosi (sono sintetizzati chimicamente e sono

39 Ancora non molto efficienti Si devono spesso utilizzare molti sirna sullo stesso gene per ottenere RNAi notevoli Si possono usare mix originati in vitro da uno stesso dsrna

40 RNAi stabile nei mammiferi Metodi basati su vettori plasmidici Espressione del senso e dell antisenso Produzione stabile di un sirna con 3 overhangs Espressione di pre-mirna che diviene un shrna con 3 overhangs ed infine un sirna Si possono utilizzare vettori inducibili e\o tessuto specifici