Number (and percentage values siding the bars) of recombinant proteins approved as biopharmaceuticals in different production systems, up to January

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Feliciano Fadda
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5 Il gene della proteina repressore ed il promotore corrispondente possono essere collocati in due plasmidi distinti, i quali mantengono nella cellula un numero di copie diverso Una simile disposizione mantiene la proporzione appropriata tra proteina repressore e promotore Di solito il gene repressore è collocato su un plasmide a basso numero di copie (da 1 a 8 copie per cellula), mentre la sequenza del promotore si inserisce in un plasmide ad elevato numero di copie (da 30 a 100 copie per cellula) Alternativamente il gene della proteina repressore può essere trasportato come singolo gene nel DNA cromosomiale, disposizione che mantiene bassi i livelli della proteina repressore Nei sistemi che fanno uso del promotore lac, una forma variante del gene laci (laci q ) produce livelli molto maggiori del repressore lac, facendo perciò diminuire la trascrizione del gene clonato in assenza di induttore 5

6 Plasmidi/cellula Plasmide 28ºC 42ºC Promotore p L pkn NO pplc SI pcp SI Repressore ci termosensibile integrato nella cellula ospite La sostituzione dell origine di replicazione aumenta di 5-10 volte il numero di copie del plasmide modificato quando si innalza la temperatura del mezzo di crescita a 42 C Inserendo il gene della DNA ligasi T4 nel plasmide pcp3, circa il 20% delle proteine cellulari prodotte a 42ºC risulta costituito da DNA ligasi T4 6

7 In generale il livello dell espressione genica è proporzionale al numero di copie del gene trascritto nella cellula ospite aumentando il numero di copie del plasmide si verificherà l aumento concomitante della proteina codificata dal gene clonato Oltre al gene clonato, però, il plasmide contiene altri geni trascritti L incremento del numero di copie determina una deviazione delle risorse della cellula verso la produzione delle proteine codificate dal plasmide, comprimendo le attività metaboliche della stessa cellula ospite La strategia alternativa consiste nel clonare più copie del gene in esame in un plasmide a basso numero di copie, anziché clonarne una sola copia in un plasmide ad elevato numero di copie Il problema tecnico è quello di creare serie in tandem di un gene con le sequenze sempre orientate nel verso giusto per essere trascritte e tradotte 7

8 E possibile utilizzare adattatori direzionali sintetici = brevi sequenze di oligodeossiribonucleotidi aggiunte alle estremità del DNA di un plasmide linearizzato ed al frammento di DNA contenente il gene Durante la reazione di ligasi i segmenti di DNA saranno orientati in un solo verso Nella pratica l espressione dei geni dell interferone si accentua realmente in proporzione al numero di copie di geni in tandem, almeno fino a quattro copie del gene per ogni plasmide Le copie dei geni in tandem risultano talvolta instabili a livello del DNA e, nel corso della crescita, alcune di esse, o anche tutte, possono essere eliminate dal plasmide 8

9 Nell mrna dei procarioti è presente un sito di inizio della traduzione definito sito di attacco del ribosoma (sequenza di Shine-Dalgarno) Si tratta di una sequenza di 6-8 nucleotidi (ad esempio UAAGGAGG), posta nell mrna, in grado di appaiarsi con una sequenza complementare situata nella componente RNA della subunità ribosomiale minore Quanto più forte è il legame dell mrna con l RNA ribosomiale tanto maggiore è l efficienza dell inizio della traduzione Sono stati progettati numerosi vettori di espressione in E.coli atti ad assicurare che l mrna del gene clonato contenga un sito di attacco forte per il ribosoma 9

10 Per ciascun gene clonato è importante stabilire che il sito di legame del ribosoma sia ubicato a una distanza precisa dal codone di inizio della traduzione e che la struttura secondaria dell mrna non ne impedisca l accesso al ribosoma Sono stati elaborati numerosi vettori che incorporano sia i segnali trascrizionali sia i segnali traduzionali per l espressione eterologa di geni eucariotici in E.coli pkk233-2 Marcatore selezionabile Amp r Il promotore tac Il sito di attacco del ribosoma di lacz Un codone di inizio ATG collocato 8 nucleotidi a valle I codoni di arresto (terminatori) della trascrizione T1 e T2 del batteriofago λ 10

11 Si inserisce il gene clonato in un sito NcoI, PstI o HindIII posto tra il sito di legame del ribosoma ed i codoni di arresto della trascrizione Se il gene clonato non si trova nella stessa cornice di lettura del codone di inizio ATG si possono effettuare piccoli adattamenti per correggere la cornice di lettura In seguito all induzione e alla trascrizione, l mrna del gene clonato è tradotto in maniera efficiente Le sequenze nucleotidiche che codificano gli amminoacidi nella regione N-terminale della proteina bersaglio variano da un gene all altro e non è dunque possibile progettare un vettore che sopprima in tutti i casi la possibilità che l mrna si ripieghi su se stesso I vettori di espressione descritti sono punti di partenza per ottimizzare l inizio della traduzione 11

12 Quando un gene clonato utilizza codoni ai quali la cellula ospite ricorre raramente, si verifica un incompatibilità cellulare che può interferire con una traduzione efficiente Può accadere che la cellula ospite non produca a sufficienza i trna che riconoscono i suddetti codoni di impiego raro e la resa in proteina del gene clonato risulta conseguentemente inferiore alle aspettative La presenza di insufficienti quantità di trna può determinare infatti un rallentamento della traduzione, un arresto precoce della traduzione o l incorporazione di un amminoacido errato, con conseguente sintesi di forme varianti della molecola proteica di interesse 12

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14 Utilizzo preferenziale di uno specifico codone per codificare l amminoacido Arg 14

15 Di solito la presenza di un piccolo numero di codoni rari non determina un abbassamento significativo dei livelli di espressione Gli effetti sui livelli di espressione possono essere severi se nel gene clonato i codoni rari sono numerosi o presenti in clusters Gli effetti più severi sull espressione sono stati osservati in presenza di più codoni rari consecutivi localizzati all estremità 5 della sequenza codificante 15

16 Codoni rari in E.coli Geni di E.coli con elevati livelli di espressione (195 geni) 4290 geni di E. coli analizzati 16

17 Problemi di traduzione simili a quelli determinati dal codon usage possono essere provocati da alti livelli di espressione di proteine caratterizzate da un amminoacido abbondante. In questo caso il livello di espressione può essere migliorato fornendo l amminoacido limitante nel mezzo di coltura. 1. SODDISFARE LA RICHIESTA E stato dimostrato che il livello di espressione di una proteina il cui gene contiene codoni rari può essere aumentato in maniera significativa rifornendo la cellula ospite dei corrispondenti trna Si possono inserire i geni codificanti i trna in questione in un plasmide, che può essere lo stesso vettore di espressione o un plasmide compatibile E stato creato un vettore, prare, contenente i geni codificanti i trna per i codoni rari di Arg, Ile, Gly, Leu e Pro 17

18 Codoni rari in E.coli Geni di E.coli con elevati livelli di espressione (195 geni) 4290 geni di E.coli analizzati trnas rari o assenti CCC CUA argu riconosce le triplette AGG/AGA GGA AUA 18

19 Tali plasmidi sono stati adoperati per trasformare diversi ceppi di E.coli E stata così creata la serie Rosetta TM di ospiti batterici per l espressione Tali plasmidi sono compatibili con i vettori pet e con altri vettori di espressione batterici I ceppi Rosetta hanno consentito di ottenere elevati livelli di espressione di proteine i cui geni contenevano codoni rari di E.coli 2. OTTIMIZZAZIONE DEI CODONI Produzione di una versione del gene contenente i codoni utilizzati più comunemente dalla cellula ospite SINTESI CHIMICA MUTAGENESI 19

20 Ceppo di E.coli BL21(DE3)pLysS Presenta mutazioni della proteasi lon ed è privo della proteasi della membrana esterna ompt, ciò che riduce gli eventi proteolitici a carico delle proteine ricombinanti E un ceppo batterico DE3, dunque presenta nel cromosoma una copia del gene codificante la RNA polimerasi T7, sotto il controllo del promotore lacuv5 L espressione proteica è sotto il controllo del promotore T7 Presenta un plasmide contenente una copia del gene che codifica il lisozima T7, espresso a bassi livelli Il lisozima T7 lega l RNA polimerasi T7 inibendo la trascrizione guidata da questo enzima In seguito ad induzione con IPTG, la produzione ad elevati livelli dell RNA polimerasi T7 sopprime ogni inibizione da parte del lisozima T7 Analisi dell espressione di una specifica proteina ricombinante Il costrutto codifica una proteina di 358 amminoacidi del peso molecolare di 40 kda e contiene 9 CCC, 8 AGA/AGG, 6 GGA, 6 CGG/CGA, 2 AUA, 1 CUA per un totale di 32 codoni rari (8,9%) E riportata un analisi mediante SDS-PAGE di estratti cellulari totali BL21 (DE3) Rosetta (DE3) BL21 (DE3) plyss Rosetta (DE3) plyss M I U I U M I U I U 20

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