laboratorio biotecnologie zootecniche BAA/LM 3CFU

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1 laboratorio biotecnologie zootecniche BAA/LM 3CFU

2 Calendario accademico Inizio delle Lezioni: 6 Marzo 2012 Fine delle Lezioni : 5 Giugno 2012 Inizio vacanze di Pasqua: 6 Aprile Fine vacanze di Pasqua: 10 Aprile 12 lezioni da 2 ore Martedì 14/16 aula 16

3 Organizzazione corso Lezioni frontali Esercitazioni in laboratorio Presentazioni power point su articoli assegnati entro maggio

4 Lezioni frontali martedì aula 16 La tracciabilità genetica Utilizzo di marcatori genetici per l identificazione di specie Utilizzo di marcatori genetici per l identificazione di razza Embryo transfer

5 Tracciabili tà la capacità di risalire alla storia e all uso o alla collocazione di un prodotto o di un attività attraverso identificazioni documentate. (ISO 8402/1992) la capacità di ricostruire e seguire il percorso di un alimento, di un mangime, di un animale destinato alla produzione alimentare o di una sostanza destinata o atta ad entrare a far parte di un alimento o di un mangime attraverso tutte le fasi della produzione, della trasformazione e della distribuzione la capacità di mantenere il controllo dell origine dei

6 Perché introdurre un sistema di tracciabilità? B.S.E. Polli alla diossina Contaminazioni microbiche O.G.M. Tematiche ambientali e benessere animale Globalizzazione

7 Tipologie di tracciabilità Tracciabilità etichettature convenzionale: sistemi di

8 Tipologie di tracciabilità Tracciabilità etichettature convenzionale: sistemi di

9 Tipologie di tracciabilità Tracciabilità etichettature convenzionale: sistemi di Tracciabilità genetica: l identificazione degli animali e dei loro prodotti avviene tramite l analisi del DNA. Permette un identificazione individuale, di razza e di specie.

10 La tracciabilità genetica: Basata sul concetto che il DNA è: Inalterabile; Stabile ai trattamenti subiti nel corso delle trasformazioni; Presente in ciascuna cellula dell organismo. L analisi del DNA viene effettuata tramite l uso di marcatori molecolari.

11 Marcatori e tracciabilità individuale Utilizzando contemporanemente più marcatori si ottengono profili allelici in grado di identificare in modo univoco gli individui impronte digitali del DNA (fingerprinting). Se il profilo dell individuo è unico o è altamente probabile che lo sia, posso riconoscere l individuo stesso a partire da campioni di tessuto (sangue, pelo, carne, latte) dai quali ottengo il DNA da sottoporre all analisi dei marcatori

12 Tracciabilità lungo la filiera della carne

13 tracciabilità di razza garantire produzioni che si ottengono solo con animali di una particolare razza formaggio Parmigiano Reggiano di sola Reggiana formaggi disolabruna. Russo V., et al. (2003) Proc. 54th EAAP meeting, August 31st September 3rd, Rome

14 Trasmissione ereditaria del locus Extension ( E ) Alleli ED = nero E+ = bruno e = rosso Genotipi ED ED = nero ED E+ = nero ED e = nero E+ E+ = bruno E+ e = bruno e e = rosso Frisona Bruna Reggiana, Simmental V. Russo Palermo 16 Aprile 2005

15 Esercitazioni Identificazione di specie impiegate nella produzione di formaggio L esperimento proseguirà per l intera durata del corso (presenza raccomandata) Definire l orario in base alle lezioni

16 Esperimento Estrazione DNA da formaggio Controllo del DNA estratto su gel di agarosio e quantificazione con DTX PCR dei frammenti da anlizzare Conrollo PCR su gel di agarosio Digestione con enzimi di restrizione Verifica della digestione su gel di agarosio e score dei risultati

17 Estrazione Kit Qiagen Il DNA viene estratto dalle cellule somatiche nel latte

18 Estrazione DNA Blood & Tissue Qiagen modificato per formaggi 1.Accendere il bagnetto a 55 C e impostare la centrifuga a 6000 g (8000 rpm) a t. ambiente; 2.in una provetta da 1.5 o 2 ml mettere 150 ng (una scagliette) di formaggio con 25 ul di proteinase K 360 ul di ATL; 3.incubare a 55 C per 4 ore; 4.aggiungere 400 ul di buffer AL e incubare a 70 C per 10 minuti; 5.aggiungere 420 ul di etanolo (96-100%) e vortexare bene; 6.trasferire il tutto in Dneasy Mini spin column posta in 2 ml collection tube e centrifugare per 1 minuto; 7.scartare il tubo con il liquido e sostituirlo con un nuovo; 8.aggiungere 500 ul di Buffer AW1 e centrifugare per 1 minuto; 9.scartare il tubo con il liquido e sostituirlo con un nuovo; 10.aggiungere 500 ul di Buffer AW2 e centrifugare a g (14000 rpm) per 3 minuti; 11.scartare la fase liquida facendo attenzione che la colonnina non ne venga a contatto e ripetere la centrifugata per 1 minuto per asciugare bene la membrana; 12.buttare il tubo facendo attenzione a non toccare la colonnina e mettere un nuovo tubo da 1.5 o 2 ml; 13.mettere 100 ul di Buffer AE, incubare a 70 C per 10 minuti e centrifugare per 1 minuto a 6000 g (8000 rpm) per la eluizione; 14.rimettere l'eluito nella membrana e centrifugare per 3 minuti; 15.dalla eluizione aliquotare per ogni campione: 16.conservare a 4 C.

19 PCR-RFLP Amplificazione PCR seguita da digestione con enzimi di restrizione SNP- specifici Gli alleli differiscono per la presenza o assenza di un sito riconosciuto da una specifica endonucleasi di restrizione

20 PCR: denaturazione La molecola del DNA si svolge e le due eliche si separano C

21 PCR: ibridazione (annealing) I primers si ibridano con le sequenze complementari dei filamenti bersaglio formando dei corti frammenti di DNA a doppia elica che fungeranno da innesco per la reazione di sintesi da parte della DNA polimerasi C

22 PCR: estensione A partire da ciascun primer ibridato la Taq polimerasi sintetizza due nuove catene complementari a quelle dello stampo, in direzione 5 -> C

23 Ad ogni ciclo raddoppia il numero di molecole di DNA bersaglio Mediante la ripetizione dei cicli di denaturazione, ibridazione ed estensione aumentano esponenzialmente le copie del frammento bersaglio (target) prodotte n

24 COME SI IDENTIFICANO I RFLP Step 1. PCR 350 bp Mutazione A->G Step 2. Digestione con EcoRI: allele 1 è tagliato, allele 2 no.

25 Step 3. Gel di elettroforesi Step 4. Visualizzazione delle bande di DNA. Il gel contiene Bromuro di Etidio che si lega al DNA ed emette fluorescenza quando illuminato con raggi UV. Se il sito di restrizione non è mutato (allele 1) ci si attende la presenza di 2 frammenti di DNA (uno di 200bp e l altro di 150 bp). Se il sito di restrizione è mutato (allele 2) ci si attende la presenza di 1 frammento di DNA di 350 bp. 2/2 1/1 1/2

26 G C

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28 Protocollo PCR Primers: TYRP1 (tyrosinase-related protein 1) MSHR1 (Melanocortin receptor 1) Si prepara una mix contenente Taq polimerasi, un buffer, primers, dntps lavorando in ghiaccio Si aggiunge il DNA Si mette la reazione nel termociclatore Polimorfismi SNP

29 Qui in laboratorio locus SCD Lunghez frammento 309

30 Presentazioni power point articoli assegnati entro maggio