IL SECRETO DI LUMACA: ANALISI MICROBIOLOGICHE A COMPLEMENTO DELL INDAGINE CHIMICA. Cherasco 26 Settembre 2014

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1 IL SECRETO DI LUMACA: ANALISI MICROBIOLOGICHE A COMPLEMENTO DELL INDAGINE CHIMICA Cherasco 26 Settembre 2014 La lumaca nel piatto:chi va piano va sano e va lontano Dr. Claudio Trapella; Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche Università degli Studi di Ferrara

2 ESTRAZIONE L estrazione meccanica della bava di lumaca è stata effettuata grazie alla collaborazione con l azienda agricola COLOGNESI di Gualdo in provincia di Ferrara che detiene il brevetto della macchina per l estrazione. L estrazione avviene attraverso uno stimolo chimico (NaCl) e grazie alla temperatura dell acqua, le lumache non subiscono quindi nessun maltrattamento (% soppravvivenza 98%).

3 STORIA E SCOPERTA STUDIO CONDOTTO NEL 2010 EFFETTO ANTIRUGHE

4 CARATTERIZZAZIONE La caratterizzazione dell estratto di lumaca per la vendita alle industrie cosmetiche o alimentari viene effettuata su 3 livelli per garantire un prodotto di elevata qualità: 1.Caratterizzazione dell estratto secco quindi % di sostanza secca all interno del secreto. L analisi di spettrofotometria infrarossa permette quindi di valutare la presenza di proteine all interno dell estratto. 2.Analisi dei metalli pesanti attraverso spettrofotometria di Assorbimento Atomico per valutare i metalli buoni (Na, K, Ca, Mg, Cu, Zn) e quelli cattivi (Cr, Pb, Ni). 3.Analisi Microbiologica del campione appena estratto per valutare la carica batterica totale Sull estratto di bava di lumaca, quali sofisticazioni possibili?

5 CARATTERIZZAZIONE CHIMICA ALLANTOINA ACIDO GLICOLICO

6 PRIMA EVIDENZA IN LETTERATURA DELL USO DELLA SPETTROFOTOMETRIA INFRAROSSA

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9 CARATTERIZZAZIONE CHIMICA SPETTROFOTOMETRO ALL INFRAROSSO IL MUCO DI LUMACA ESSENDO UN COMPOSTO NATURALE PRESENTA UN ELEVATA COMPLESSITA. LE SUE PROPRIETA FARMACOLOGICHE NON SONO RICONDUCIBILI ESCLUSIVAMENTE ALLA SUA COMPOSIZIONE CHIMICA E AMMINOACIDICA.

10 CARATTERIZZAZIONE CHIMICA

11 DIFFERENZE TRA SPECIE HELIX ASPERSA MULLER %SS= 6.7% HELIX ASPERSA MAXIMA %SS= 6.0% HELIX POMATIA %SS= 4.8%

12 ANALISI INFRAROSSA DEL MUCO TOTALE DI HELIX ASPERSA

13 ANALISI DEI METALLI PESANTI A. HELIX ASPERSA MULLER B. HELIX ASPERSA MAXIMA C.HELIX POMATIA Conc. Metalli nella carne Metallo Concentrazione Valore minimo Valore massimo Valore medio Calcio mg/ Fosforo Magnesio Potassio Sodio Rame Ferro Manganese Zinco Prof. Bracchi, Prof Novelli. Università di Parma

14 AZOTO TOTALE E PROTEINE TOTALI CON IL METODO DEL KJELDHAL Analisi elementare Summarize Results Date : 1/23/ :55:41 Method Name : default Method Filename : Default.mth Group No : 1 Element % Sample Name Nitrogen Carbon Hydrogen Sulphur SNAIL1 0, , , , SNAIL2 0, , , , SNAIL3 0, , , , SNAIL4 0, , , , SNAIL5 0, , , ,

15 TRE CAMPIONI DI BAVA DI LUMACA PURA Sample gr azoto 6.81gr proteine Sample gr azoto 9.77gr proteine sample gr azoto 9.30gr proteine Kjeldahl come metodo di analisi Proteine= N totx 6.25 TRE CAMPIONI DI BAVA DI LUMACA ADULTERATI Sample A: 800mg bava 200mg BSA Sample B: 800mg bava 200mg NH4Cl Sample C: 1000mg bava 2.64gr N tot 16.5gr Proteine 5.42gr N tot 33.8gr Proteine 1.56gr azoto 9.77gr proteine

16 Spettro infrarosso di bava di lumaca con aggiunta di BSA

17 Spettro infrarosso di bava di lumaca con aggiunta di NH 4 Cl

18 ANALISI MICROBIOLOGICHE VALUTAZIONE CARICA BATTERICA Semina di 100ul a conc 100ug\ul ( 1mg in tot) su: TSA (carica batterica tot) Mannitol Salt Agar ( Stafiloccocchi) McConkey ( Coliformi) Sabouraud + Cloramfenicolo ( Miceti) RISULTATI: Carica batterica totale pari a 4 x 10^-2 CFU\mg con presenza di soli Bacilli gram positivi GRAM SU TSA GRAM MANNITOL SALT AGAR

19 CURVA DI CRESCITA BATTERICA 100ul BAVA (10mg) in un ml finale Fold increase E.Coli MIN NT BAVA Fold increase P.Aeruginosa MIN NT BAVA RALLENTAMENTO CRESCITA DEI GRAM NEGATIVI Fold increase S.Aureus NT BAVA Fold increase S.Mutants NT BAVA Fold increase C.Albicans NT BAVA MIN MIN MIN

20 DETERMINAZIONE MIC (minima concentrazione inibente) Coltura per 24h in 100ul totali (1x10^4 batteri) con diluizioni seriali di bava % inhibition E.Coli S.Aureus P.Aeruginosa C.Albicans 50ug/ul 25ug/ul 12.5ug/ul 6.25ug/ul 3.125ug/ul E.coli S.Aureus C.Albicans 0 50ug/ul 25ug/ul 12,5ug/ul 6,25ug/ul 3,125ug/ul P.Aeruginosa Alla concentrazione di 50ug/ul tutti e 4 i microrganismi vengono inibiti nella crescita, in particolare i gram negativi. Questi ultimi sono leggermente inibiti anche alla concentrazione di 25ug\ul. P.Aeruginosa, E. Coli: Garm Staphylococcus. Aureus Gram + C albicans Fungo

21 ANALISI MICROBIOLOGICHE CONCLUSIONI: 1. LA BAVA LIOFILIZZATA NON CONTIENE UNA CARICA BATTERICA POTENZIALMENTE NOCIVA IL PROCESSO DI LIOFILIZZAZIONE GARANTISCE UNA BUONA PUREZZA MICROBIOLOGICA 2. IL PREPARATO MOSTRA ATTIVITA BATTERIOSTATICA SOPRATTUTTO SUI GRAM NEGATIVI E.COLI E P.AERUGINOSA SONO INIBITE GIA ALLA CONCENTRAZIONE DI 25ug/ul

22 PROSPETTIVE 1. Analisi più dettagliata (Proteomica) dei componenti di Helix Aspersa Muller per identificare le proprietà biologiche associate ai vari componenti. 2. Valutazione delle possibili frodi sul prodotto attraverso l analisi infrarossa associata all analisi dell azoto totale e dell acido glicolico e dell allantoina via HPLC. 3. Collaborazione con l Azienda ospedaliera di Ferrara, il Tecnopolo per le Scienze della Vita e aziende biomedicali della RER per un progetto di messa a punto di garze e teli medicati per le ustioni e le piaghe da decubito (POR-FESR ).

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