Test dell'antiglobulina Ricerca e identificazione degli Anticorpi antieritrocitari

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1 Test dell'antiglobulina Ricerca e identificazione degli Anticorpi antieritrocitari

2 Test di Coombs Le immunoglobuline di classe IgG non sono in grado di legare contemporaneamente due antigeni, situati su due distinte cellule, per la presenza del potenziale ζ e per le proprie dimensioni Abbassare fortemente il potenziale può avvicinare le membrane cellulari, ma innesta fenomeni aspecifici di aggregazione Anche la riduzione della forza ionica I oltre.3 mol/l porta a falsi positivi L'uso di sieri antiglobuline umane è in grado di creare ponti intracellulari legandosi alle IgG adese alle cellule, dando origine ad una agglutinazione

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4 Il siero antiglobuline prende il nome di siero di Coombs ed i test in cui è usato sono chiamati test di Cooms diretto e indiretto Test di Cooms diretto = Ricerca IgG direttamente presenti sulla cellula come conseguenza di una immunizzazione in atto nel paziente (in prevalenza patologie autoimmuni) Test di Coomb indiretto = Ricerca anticorpi,presenti nel siero del soggetto in esame, su globuli rossi test sensibilizzati

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6 Test di Coombs diretto: metodica 1) prelevare il campione con anticoagulante (EDTA) per impedire in vitro la fissazione del complemento sui globuli rossi sospesi nel proprio siero 2) sospendere i globuli rossi in salina al 5% e lavare ripetutamente (almeno tre volte) con soluzione fisiologica, per allontanare tutte le immunoglobuine presenti non legate alle cellule 3) centrifugare ed aggiungere il siero anti immunoglobuline 4) mescolare con cura, centrifugare e leggere per la agglutinazione risospendendo le cellule presenti sul fondo della provetta

7 Test di Coombs indiretto: metodica E' costituito da due fasi: la prima è relativa al legame tra il determinante antigenico sui globuli rossi test e l'anticorpo eventualmente presente nel siero in esame La seconda alla reazione con l' antiglobulina ed alla formazione dell'agglutinato Nella prima fase sono critici: i valori delle variabili considerate nella reazione ATG/ATC ( temperatura, ph, forza ionica, concentrazione dei reagenti tempo di incubazione) Nella seconda fase sono punti critici: distanza tra le cellule (pζ), i lavaggi delle emazie sensibilizzate, la velocità di centrifugazione,le modalità di lettura dei risultati

8 Il test indiretto eseguito in salina è il capostipite di tutti quelli attualmente in uso Procedura: 1) lavare ripetutamente le emazie test in sol. fisiologica (3-6 volte) 2) risospenderle in fisiologica alla concentrazione del 3-5% 3) porre in provetta 2 gocce di siero in esame e 2 di sospensione cellulare 4) incubare a 37 C per 2 ore 5) centrifugare la provetta,eliminare il sovranatante e lavare con sol.fis. 3 volte 6) aggiungere il siero antiglobuline e mescolare accuratamente 7) centrifugare e leggere per l'agglutinazione

9 Il test precedente può essere modificato aggiungendo nella prima fase della reazione agenti potenzianti come il LISS, l' albumina o il polietilenglicole (PEG),. In questo modo si ottiene una riduzione del tempo di incubazione ed un aumento della sensibilità del test. Metodica LISS in provetta 5μL di siero + 25μL di globuli rossi al 3% + 5μL di LISS Incubare per 2 minuti a 37 C Effettuare tre lavaggi con soluzione fisiologica Aggiungere 5μL di antiglobulina ad ampio spettro Centrifugare e leggere per l'agglutinazione

10 Metodo in microcolonna (gelfiltrazione) Principio del metodo. Le microcolonne sono riempite con gel imbibito di siero anti IgG, nella parte superiore della colonna è già presente il LISS. Si pipettano 5 μl di globuli rossi test allo.8% e 25μL di siero in esame. Si lascia incubare per 15-2 minuti e si centrifuga per 1 minuti a 9 RPM Se nel siero è presente un anticorpo diretto contro il suo antigene eritrocitario, si forma un agglutinato di dimensioni variabili a seconda della reattività anticorpale, che viene trattenuto nelle maglie del geil. In assenza di anticorpo le cellule scendono sul fondo della colonna

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12 Test in fase solida Principio del test I pozzetti di una micropiastra sono ricoperti di Antigene in grado di legare immunoglobuline del siero Si aggiungono al pozzetto 1μL di LISS e 5μL di siero. Gli ATC presenti si fissano alla parete del pozzetto. Si allontanano con 6 lavaggi i componenti che non hanno reagito. Si aggiungono 5μL di globuli rossi test che si legano agli anticorpi, Si centrifuga a 5g per 3 minuti Lettura spettrofotometrica dei risultati

13 Test in fase solida Principio del test I pozzetti di una micropiastra sono ricoperti di Antigene in grado di legare immunoglobuline del siero Si aggiungono al pozzetto 1μL di LISS e 5μL di siero. Gli ATC presenti si fissano alla parete del pozzetto. Si allontanano con 6 lavaggi i componenti che non hanno reagito. Si aggiungono 5μL di globuli rossi test che si legano agli anticorpi, Si centrifuga a 5g per 3 minuti Lettura spettrofotometrica dei risultati

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16 Test con enzimi Bromelina (ananas), ficina (fichi) e papaina (papaya) sono enzimi ampiamente usati in immunoematologia per la possibilità di ridurre o esaltare la reattività degli antigeni eritrocitari in seguito alla loro azione sulla membrana cellulare. Gli anticorpi anti Rh,P, I, Jk e Le sono più facilmente identificabili, mentre anti Fy e quelli del sistema MNS sono più deboli

17 Test enzimatico con emazie pretrattate con enzimi ( più frequentemente con ficina)

18 Test con polietilenglicole (PEG) Il PEG quando aggiunto all'antiglobulina aumenta la sensibilità e specificità della reazione. Procedura: 2 gocce di siero in esame + 4 gocce di PEG 2% in PBS + 1 goccia di cellule Incubare per 15 minuti a 37 C Non centrifugare Lavare 4 volte con soluzione fisiologica Aggiungere siero antiglobuline Centrifugare e leggere il risultato

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20 False positività nel test all'antiglobulina Emazie agglutinate prima dei lavaggi (presenza di IgM ad alto titolo) Vetreria non accuratamente pulita (residui di fibrina, polvere) Centrifugazione non corretta ( se eccessiva crea agglomerati cellulari che non si disgregano in fase di lettura Centrifugare nel test con PEG prima dei lavaggi Presenza di complemento ( in particolare C4) Nella esecuzione di un test indiretto la presenza di cellule già positive al Coombs diretto, ne determina sempre la positività (es. i globuli rossi di un donatore con anemia emolitica da farmaci quando esaminati col siero di un paziente privo di anticorpi, ne simula la presenza

21 False negatività nel test all'antiglobulina Neutralizzazione del siero antiglobuline (residui di plasma o siero per lavaggi insufficienti prima dell'aggiunta del reattivo) Interrompere e riprendere il test ( le IgG possono staccarsi dai globuli rossi e dare deboli reazioni) Procedure improprie ( scarsa centrifugazione, una eccessiva concentrazione di cellule può mascherare una debole agglutinazione Dimenticare di aggiungere un reattivo durante l'esecuzione del test) Reattivi o strumentazione inadeguati (salina con ph alterato, reattivi scaduti)

22 Identificazione degli anticorpi irregolari La identificazione degli anticorpi immuni,per sensibilizzazione nei confronti di globuli rossi non appartenenti al soggetto in esame, è la condizione fondamentale per una sicura terapia trasfusionale e per il monitoraggio delle gravidanze Gli anticorpi devono essere cercati con pannelli eritrocitari che assicurino la possibilità di individuare quelli clinicamente significativi,ovvero in grado di determinare una reazione emolitica, potendo eliminare quelli di scarsa importanza clinica utilizzando i test precedentemente descritti

23 I pannelli eritrocitari sono costituiti da vari campioni di globuli rossi di donatori, di gruppo, di cui è nota la composizione antigenica D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka, and Jkb. I donatori sono selezionati, in particolare per i pannelli costituiti da 2-3 campioni, tra soggetti omozigoti per gli antigeni più comuni per evitare l'effetto dose: D, C, E, c, e, M, N, S, s, Fya, Fyb, Jka, and Jkb. Alcuni anticorpi diretti contro i sistemi Rh, MNS, Duffy, and Kidd danno deboli reazioni se le cellule del pannello sono eterozigoti

24 I pannelli per lo screening sono costituiti da 2 / 3 campioni, il loro uso serve per evidenziare la presenza di un anticorpo irregolare nel siero in esame I pannelli estesi hanno lo scopo di identificare la specificità dell'anticorpo precedentemente individuato

25 Antibody Panel vs. Screen An antibody panel is just an extended version of an antibody screen The screen only uses 2-3 cells:

26 Antibody Panel An antibody panel usually includes at least 1 panel cells:

27 Panel Group O red blood cells

28 Panel Each of the panel cells has been antigen typed (shown on antigram) + refers to the presence of the antigen refers to the absence of the antigen Example: Panel Cell #1 has 9 antigens present: c, e, f, M, s, Leb, k, Fya, and Jka

29 Panel An autocontrol should also be run with ALL panels Autocontrol Patient RBCs + Patient serum

30 Panel The same phases used in an antibody screen are used in a panel IS 37 AHG

31 Antibody ID Testing A tube is labeled for each of the panel cells plus one tube for AC: drop of each panel cell + 2 drops of the patients serum AC

32 IS Phase Perform immediate spin (IS) and grade agglutination; inspect for hemolysis Record the results in the appropriate space as shown: 2+ Last tube

33 (LISS) 37 C Phase 2 drops of LISS are added, mixed and incubated for 1-15 minutes Centrifuge and check for agglutination Record results

34 (LISS) 37 C Phase

35 IAT Phase (or AHG) Indirect Antiglobulin Test (IAT) we re testing whether or not possible antibodies in patient s serum will react with RBCs in vitro To do this we use the Anti-Human Globulin reagent (AHG) Polyspecific Anti-IgG Anti-complement

36 AHG Phase Wash cells 3 times with saline (manual or automated) Add 2 drops of AHG and gently mix Centrifuge Read Record reactions

37 AHG Phase

38 You have agglutination now what? CC ??

39 Interpreting Antibody Panels There are a few basic steps to follow when interpreting panels Ruling out means crossing out antigens that did not react Circle the antigens that are not crossed out Consider antibody s usual reactivity Look for a matching pattern

40 1. Ruling Out Cross out antigens that show NO REACTION in any phase; do NOT cross out heterozygous antigens that show dosage.

41 2. Circle antigens not crossed out

42 3. Consider antibody s usual reactivity Lea is normally a Cold-Reacting antibody (IgM), so it makes sense that we see the reaction in the IS phase of testing; The E antigen will usually react at warmer temperatures

43 4. Look for a matching pattern E doesn t match and it s a warmer rx Ab Yes, there is a matching pattern!

44 Interpretation antilea

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53 Prove di compatibilità Sono obbligatorie per la assegnazione di sangue a scopo terapeutico La loro finalità è di prevenire/impedire reazioni post trasfusionali emolitiche per la presenza nel paziente di anticorpi anti eritrocitari (naturali o irregolari) diretti contro i globuli rossi del donatore Sono basate su due principali metodiche: Cross Match Type and Screen

54 Cross match Viene effettuato per verificare la compatibiltà tra i globuli rossi del donatore e il siero del paziente per mezzo di un test all'antiglobulina Un CM negativo indica che la sacca prelevata in emoteca è trasfondibile nel paziente senza rischio di emolisi, ma non fornisce nessuna indicazione per la eventuale presenza di anticorpi irregolari diretti contro antigeni non presenti sui globuli rossi Es: donatore + K- paziente + con anti K = CM negativo paziente + senza ATC = CM negativo La presenza di anti K si evidenzia solo con una ricerca di anticorpi

55 Il Cross match è la compatibilità di scelta quando: Il paziente ha presenti nel siero anticorpi clinicamente significativi oppure esami pregressi positivi per anticorpi non più visibili Se una ricerca anticorpi non è mai stata effettuata Il paziente è politrasfuso (pat.ematologiche,emoglobinopatie) Se in anamnesi sono presenti eventi emolitici post trasfusionali Trasfusioni in neonatologia ( eventuali ATC materni )

56 Type and Screen Il TS si basa sulla considerazione che, se un paziente è privo di anticorpi irregolari, il sangue isogruppo disponibile in emoteca può essere direttamente trasfuso Questa affermazione è vera se: esiste una corretta determinazione del gruppo ematico per il paziente,,, (è prevista per legge un doppio test per la determinazione del gruppo su due distinte provette...e per le sacche dei donatori (gruppo eseguito direttamente sulla sacca) Se la ricerca di anticorpi irregolari nel siero del paziente è negativa (test all'antiglobulina indiretto)

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58 Quando utilizzare il TS Nelle trasfusioni massive (es. patologie vascolari acute, politraumi) Negli interventi chirurgici programmati Nella previsione di un intervento in urgenza (medico o chirurgico ) per pazienti ospedalizzati

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62 SIT ARCISPEDALE S. ANNA, FERRARA FREQUENZA ERRORI TRASFUSIONALI: SALAMA (FDA): , 256 CASI MORTALI 51% ERRORI ABO FDA (1993) : TASSO DI MORTALITA ASSOCIATA A TRASFUSIONE : 1/1.3. LINDEN (1997) : TASSO DI MORTALITA ASSOCIATO A TRASFUSIONE : 1/1.7. STIMA : 1 ERRORE OGNI 12 TRASFUSIONI 1 ERRORE MORTALE OGNI 5 ERRORI

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