TECNICHE DI ANALISI BIOLOGICHE

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1 TECNICHE DI ANALISI BIOLOGICHE VENERDÍ Flow chart: 1. struttura cellulare; 2. genesi cellulare; 3. organizzazione cellulare; 4. compartimentazione cellulare; 5. struttura del d.n.a.; 6. topografia delle istruzioni presenti sul d.n.a.; 7. quali e quanti sono i geni; 8. junk d.n.a.; 9. importanza del junk d.n.a. nella caratterizzazione genotipica degli individui. CELLULA: unità fondamentale degli organismi. CARATTERISTICHE: circoscritta da una membrana semi impermeabile che racchiude il citoplasma. DIMENSIONI: dell ordine dei μm. LE CELLULE BATTERICHE O PROCARIOTI: Batteri (dal greco baktétrion "bastoncino"), grande gruppo di organismi cellulari perlopiù microscopici, privi di un nucleo distinto e caratterizzati da una modaloità di riproduzione per divisione cellulare. In genere le cellule batteriche sono lunghe da 1 a 10 micron e hanno sviluppato gli adattamenti più svariati per ottenere energia e sostanze nutritive. Si trovano in quasi tutti

2 gli ambienti: nell' acqua, nel ghiaccio, nelle sorgenti e perfino negli sbocchi idrotermali delle profondità oceaniche. Alcuni proliferano sugli alimenti, mentre stabiliscono varie forme di simbiosi con piante, animali e altri organismi. Nello schema di classichificazione in cinque regni, i batteri costituiscono il regno dei procraioti e si differenzisano dalle cellule di tutti gli altri organismi viventi, chiamati eucarioti, per l'assenza di un nucleo delimitato da membrana. Il materiale genetico della cellula batterica è costituito da un doppio filamento di DNA circolare. In molti batteri sono, inoltre, presenti molecole di DNA accessorie e più piccole, dette plasmidi, che generalmente portano geni non essenziali per la riproduzione del batterio. Sono note circa 200 specie di batteri patogeni, responsabili di numerose malattie dell' uomo. Il grado di patogenicità può variare a seconda della virulenza della specie batterica e delle condizioni generali dell' organsmo ospite. Fra le melattie batteriche più gravi vi sono colera, gangrena gassosa, lebbra, peste, dissenteria, tubercolosi, sifilide, febbre tifoide, difterite, brucellosi e polmonite. Prima della scoperta dei virus, i batteri erano considerati gli agenti di tutte le malattie infettive. Sono tuttavia altrettanto numerosi anche i batteri utili:i batteri decompositori, ad esempio, trasformano le sostanze complesse degli organismi morti in sostanze semplici e in sali minerali che ritornano in ciclo e possono essere utilizzati da altri organismi. Altri batteri sono in grado di trasformare l'azoto presente nell'aria in forma utilizzabile dalle piante con le quali vivono in simbiosi. Questo processo prende il nome di fissazione dell'azoto. Batteri utili vivono nello stomaco dei ruminanti permettendo loro di digerire le fibre di cui si nutrono Il formaggio, il burro, lo yogurt sono prodotti che derivano dalla fermentazione del latte ad opera di certi tipi di batteri. Con l'aiuto dei batteri possono essere prodotte su scala industriale numerose sostanze di notevole importanza come l'alcol e gli antibiotici. L'impiego dei batteri o di altri microrganismi nella produzione alimentare si chiama biotecnologia. LE CELLULE EUCARIOTICHE: La differenza tra procarioti ed eucarioti è molto netta, al punto che non si conoscono specie viventi con strutture intermedie.

3 I procarioti sono tutti unicellulari e all'interno dell'unica cellula che li compone non si osserva nessuna compartimentazione dovuta a membrane interne: anche il materiale genetico si trova libero nel citoplasma. Tra gli eucarioti, invece, oltre a organismi unicellulari, si trovano tutti gli organismi pluricellulari. Nelle cellule che li compongono si possono distinguere sia un vero e proprio nucleo delimitato da una membrana sia alcuni organelli, anch'essi delimitati da una membrana, che hanno morfologia e funzionalità proprie e dotati di una molecola di DNA codificante un ristretto numero di proteine. Tali organelli si distinguono in mitocondri e cloroplasti. I mitocondri producono energia, che viene immaganizzata nella molecola nota come ATP, ossidando le sostanze organiche fino a ottenere anidride carbonica e acqua, mediante l'ossigeno molecolare, secondo una serie di processi metabolici denominati, nel complesso, respirazione cellulare. I cloroplasti sono gli organelli responsabili della fotosintesi nelle piante. Gli eucarioti sono divisi in due regni distinti: Archea, a cui appartengono gli archeobatteri, ed Eubacteria, a cui appartengono i batteri veri e propri, detti anche eubatteri. La distinzione degli archeobatteri dai batteri si basa su importanti differenze biochimiche e molecolari, tra le quali la mancanza di acido muramico nella parete dalla cellula degli archeobatteri. A differenza degli eubatteri, gli archeo batteri si rinvengono spesso in ambienti caratterizzati da valori estremi di salinità, temperatura e anossia che, secondo alcuni scienziati, riprodurebbero le primitive condizioni in cui si sarebbe originata la vita sulla Terra. Elementi centrali della nuova ipotesi sono la capacità di uno dei due microrganismi di produrre idrogeno e la dipendenza dell'altro all'altro idrogeno prodotto. La comparsa di fenomeni di endosimbiosi è inoltre conseguente e non propedeutica all' interazione stretta tra i metabolismi dei due microrganismi contraenti. La teoria spiegherebbe perchè nel genoma degli eucarioti ci siano anche geni non direttamente connessi alla respirazione (ad esempio quelli relativi alle proteine di membrana che permettono l'ingresso nella cellula delle sostanze necessarie per la respirazione) e renderebbe ragione della presenza di geni di natura mitocondriale in quegli eucarioti, ancora poco noti quando Lynn Margulis elaborò la teoria endosimbiotica, che sono privi di mitocondri.

4 Il corpo umano è composto da circa cellule. MITOSI: divisione cellulare che produce due cellule identiche con lo stesso genotipo, generate da una singola cellula. Questo termine viene utilizzato appunto per le cellule eucariotiche, mentre per i batteri il termine che viene utilizzato è FISSIONE CELLULARE. Il processo operato per la produzione di proteine è: D.N.A. TRASCRIZIONE m R.N.A. TRADUZIONE PROTEINE Le proteine possono essere definite come macromolecole oppure polimeri naturali. Sono costituite da venti amminoacidi naturali e possono essere composte di 100 fino 1000 aa, che conferiscono alla proteina una struttura stereochimica ben definita. STRUTTURA PRIMARIA STR. SECONDARIA STR. TERZIARIA STR. QUATERNARIA. La complessità strutturale e funzionale delle cellule è dovuta alla presenza delle proteine appunto. LE FUNZIONI PROTEICHE SONO: 1. ENZIMATIHE; 2. FUNZIONANO DA MESSAGGERI; 3. STRUTTURALI.

5 Il D.N.A. è costituito da una doppia elica, che corre dalla direzione 5 alla 3 e viceversa, tenuta insieme dall appaiamento delle basi nucleotidiche che formano tra di loro legami idrogeno. La composizione del d.n.a. è di quattro nucleotidi: ADENINA, GUANINA, CITOSINA e TIMINA.

6 La regola rappresentata nell immagine su esposta è detta regola di Chalgov. Un singolo nucleotide è costituito da fosfato + ribosio + nucleoside. Il diametro del d.n.a. è di 5 μm.

7 La distanza tra i due filamenti di d.n.a è di 6 nm. La lunghezza totale di d.n.a. all interno di un uomo è di diciotto metri. Le molecole di d.n.a. subiscono un iper avvolgimento grazie all interazione con gli istoni: H 1, H 2A, H 2B, H 3 e H 4. In media si avvolgono 146 aa attorno agli ottametri composti di coppie di H 2A, H 2B, H 3 e H 4, mentre l istone H 1 si trova tra un nucleosoma (composto da un ottametro e dal d.n.a. avvolto su di esso) ed il successivo e viene detto istone spacer, perché si trova appunto sul d.n.a. spaziatore. SISTEMA DI COLLANA DI PERLE: Gli stessi nucleosomi si avvolgono assumendo una struttura detta a SOLENOIDE, il ci diametro è di 30 nm. Il solenoide si attorciglia su sé stesso diventando cromatina, che ha un diametro di 200 nm. La cromatina i avvolge dando forma al CROMOSOMA, il cui singolo CROMATIODIO, durante la fase M, ha un diametro di 700 nm. In interfase la maggior parte della cromatina si presenta con un diametro di 30 nm.

8 Specie diverse si sono differenziate grazie al numero totale dei cromosomi all interno del nucleo cellulare (il numero di cromosomi è detto cariotipo). Tendenzialmente il cariotipo in natura ha un numero pari. In H. sapiens il cariotipo consta di 46 n (cromosomi). Il cromosoma è composto di un terzo da d.n.a. e di due terzi da proteine. La struttura del cromosoma prende il nome di CROMATINA, che è composta di EUCROMATINA ed ETEROCROMATINA.

9 L eterocromatina si colora di un colore scuro ed è costituita dalla parte di cromosomi che non operano sintesi proteica, mentre l eucromatina non si colora ed è la parte che contiene la maggior quantità di informazioni necessarie per la sintesi proteica. I cromosomi interagiscono con la membrana nucleare, quindi con i pori, in modo che possano essere sia trascritti sia duplicati; esistono quindi zone o domini intranucleari organizzati. Il CICLO CELLULARE si suddivide in due fasi principali a loro volta suddivise in più fasi: 1. CRESCITA CELLULARE: G 1 = GAP 1, fase in cui vengono prodotte le proteine; S = fase di SINTESI, cioè viene duplicato il d.n.a.; G 2 = GAP 2, fase di preparazione per la divisione; 2. FASE MITOTICA: La cellula suddivide due nuclei; Citokinesi. SCAFFOLD: IMPALCATURA. S.A.R.: scaffold attachment region. Sono le aree specifiche in cui il d.n.a. compatta maggiormente la sua struttura. LEZIONE N. 2

10 Il dna si può presentare come dna a doppia elica o double strand (ds) ovvero come dna a singola elica o single strand (ss). Il dna può essere suddiviso in due tipologie distinte: 1. dna codificante, cioè il gene vero e proprio; le parti del cromosoma contenente i geni sono definiti loci; 2. dna non codificante. I geni in media anno una sequenza di bp (base pair) ed iniziano con un codone di inizio ATG, terminando con un codone terminale TGA etc. Il verso del gene è parallelo al verso del dna contenuto all interno dei cromosomi stessi, cioè 5 ATG TGA sequenze regolatrici locus sequenze regolatrici a monte a valle ATG TGA All interno dei loci sono presenti introni (sequenze non codificanti) ed esoni (sequenze codificanti). Il genoma aploide umano ha dimensioni dell ordine di grandezza di 3 * 10 9 bp. Il numerosi geni stimati è di 3*10 4. Il 90% del nostro genoma è composto da sequenze non codificanti. Questo comporta il cosiddetto paradosso del valore C, che indica il contenuto genomico. I geni sono carenti nelle regioni terminali dei telomeri e centrali dei cromosomi, dette centromeri. I geni più frequenti codificano per: dnasi; kinasi; recettori; citoscheletro. I geni sono quindi suddivisibili in due categorie: housekeaping genes o geni costitutivi, che sono attivi in tutti i tessuti e codificano per proteine essenziali per il normale funzionamento delle cellule. Se vengono inattivati la cellula muore; inducile genes o geni inducubili, che vengono attivati a seconda dei fattori ambientali, differenziativi o cronologici.

11 Il dna extragenico non è codificante e si può suddividere in: sequenze singole, che sono presenti in unica copia; sequenze ripetute, che sono presenti in molteplice copia, spesso sono organizzati in tandem. Inventory of a eukaryotic genome Moderately repetitive DNA Functional dispersed gene families e.g. actin, globin tandem gene family arrays rrna genes (250 copies) trna genes (50 sites with copies each in human) histone genes in many species Without known function short interspersed elements (SINEs) Alu is an example (some function in gene reg ulation) bp long 's of copies ( Alu) scat tered locations (not in tandem repeats) long interspersed elements (LINEs) 1 5 kb long copies per genome pseudogenes Highly repetitive DNA minisatellites composed of repeats of bp segments 1 5 kb long many different ones scattered throughout the genome microsatellites composed of repeats of up to 13 bp ~100s of kb long ~ 10 6 copies/genome most of the heterochromatin around the centromere telomeres contain a short repeat unit (typically 6 bp: TTAGGG in human genome, TTGGGG in Paramecium, TAGGG in trypanosomes, TTTAGGG in Arabidopsis) repeats at the ends of each chromosome Durante la duplicazione del dna capita che vengano fatti alcuni errori di copiatura durante l inserimento delle basi sul filamento di nuova generazione. Grandi sequenze non codificanti dovrebbero funzionare da tamponi contro le mutazioni. Il polimorfismo (cioè la differenza) dei loci risulta quindi essere molto importante, soprattutto per quanto riguarda le sequenze on codificanti. Nelle sequenze tandem è più facile sbagliare durante la copiatura. Mutazioni all interno delle cellule germinali sono ereditate Per comprendere se un individuo è omozigote od eterozigote per un determinato locus bisogna sfruttare il processo elettroforetico (fingerprint).

12 Types of genetic differences between people Differences (misspellings in our book) in DNA segments between any two persons can be used as genetic markers, which are fragments of DNA that can be distinguished from one another because of differences in their nucleotide sequences. Types: 1. Single Nucleotide Polymorphisms : also known as SNPs. Are a single base pair change in a single strand of DNA. These are the most prevelant form of differences between any two individuals. 2. Minisatellites: nucleotides repeated several times in tandem; bordered by unique DNA sequences. Variable Number Tandem Repeats (VNTR) is an example. There are about 50,000 VNTRs in the human genome. 3. Microsatellites: also called Short Tandem Repeats (STRs). Similar to Minisatellites but sequence repeats are smaller. Examples are tetraand di-nucleotide sequence repeats....