INTERPRETAZIONE CRITICA DEGLI ESAMI COAGULATIVI DI PRIMO LIVELLO

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1 INTERPRETAZIONE CRITICA DEGLI ESAMI COAGULATIVI DI PRIMO LIVELLO Barbara Montaruli Laboratorio Analisi Ospedale Evangelico Valdese, Torino

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4 Fasi processo emostatico ADESIONE PIASTRINICA

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6 Fasi processo emostatico ATTIVAZIONE PIASTRINICA

7 S H A P E C H A N G E ADP, TxA2, PAF : attivano plts

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9 S H A P E C H A N G E

10 Fasi processo emostatico AGGREGAZIONE PIASTRINICA

11 Aggregazione

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13 Fasi processo emostatico ATTIVAZIONE COAGULAZIONE

14 Fasi processo emostatico ATTIVAZIONE FIBRINOLISI

15 Processo Coagulativo

16 Cascata Enzimatica 1 enzima converte substrato in un 2 enzima Enzimi sono altamente specifici, le reazioni non possono essere bypassate L ultimo attiva un altro substrato, e così via.. Spesso durante l attivazione dei substrati vengono rilasciati piccoli marker di attivazione della cascata in vivo (F1+2)

17 Processo Coagulativo Il processo coagulativo avviene sulla superficie (PL) delle cellule e in presenza di cofattori!!!! Cofattori

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19 Fattori vitamina K dipendenti VII IX X II posseggono GLA domain (residui di acido y carbossi glutammico) essenziali per il legame con i PL anionici. La carbossilasi che interviene nell attacco dei GLA domain ai fattori ha bisogno della vit. K

20 Fattori vitamina K dipendenti GLA domain F VII Se GLA domain mancano non possono attaccarsi alle superfici anioniche, pertanto le reazioni coagulative avvengono in maniera molto rallentata PL

21 Via Intrinseca e Comune

22 Via Estrinseca e Comune

23 Coagulazione nuovo schema

24 Cascata coagulativa: nuovo schema

25 Formazione Fibrina

26 Fibrinogeno

27 Formazione di fibrina

28 Formazione di fibrina

29 Formazione di fibrina Legami covalenti

30 Meccanismi controllo coagulazione AT

31 Fase pre-analitica Un controllo non ottimale delle variabili connesse al prelievo, al trattamento e alla conservazione del campione può compromettere in modo sostanziale l affidabilità della risposta nei test di coagulazione. Fase pre-analitica: condizioni paziente al momento prelievo raccolta campione di sangue modalità prelievo contenitore anticoagulante e sua concentrazione rapporto sangue anticoagulante preparazione plasma conservazione campione (sangue intero o plasma)

32 Fase pre-analitica variabilità biologica del paziente Fattori a lungo termine età neonati tempi coagulazione più lunghi - fattori vitamina K dipendenti più bassi si normalizzano 5a-10a settimana menopausa: aumentano VII e VIII sesso non esistono differenze sostanziali fra i due sessi per quello che riguarda i test globali gravidanza aumento attività maggior parte fattori, diminuisce PS, APC resistance acquisita Fattori a breve termine stress aumento VIII e VIII:Ag attività fisica aumento VIII e VIII:Ag fumo aumento fibrinogeno, VIII e VIII:Ag farmaci danno epatico (anestetici, antibiotici, antidepressivi anineoplastici ), piastrinopenia antimitotici, aspirina, eparina..), piastrnopatia asprina, anestetici ) traumi aumento fibrinogeno, VIII:C e VIII:Ag ritmi circadiani firbrinogeno aumenta e APTT diminuisce nel corso della giornata gruppo sanguigno gruppo 0 numero plts ridotto, VIII e VIII:Ag più bassi Sono importanti ai fini della definizione dei corretti intervalli di riferimento.

33 Fase pre-analitica raccolta campione di sangue Minore traumatismo possibile e con minima stasi per evitare il rilascio TF. Mai usare per prelievo cateteri a permanenza per il pericolo di contaminazione da farmaci (eparina!!!!!!!) oppure scartare i primi ml. Uso di sistemi sottovuoto è preferibile al prelievo tradizionale con ago e siringa perché vi è una maggiore standardizzazione nella forza di aspirazione e una minore incidenza di emolisi. Imperativo uso di materiale non contattante ovvero incapace di attivare XII e XI plastica o vetro siliconato.

34 Fase pre-analitica raccolta campione di sangue Anticoagulante: citrato di sodio alle concentrazioni 3.2% (0.109M del sale dididrato) o 3.8% (0.129M del sale diidrato). diverse concentrazioni danno valori di INR diversi in funzione dello strumento usato. gli organismi preposti alla standardizzazione consigliano il 3.2% (0.109M). In Italia la più prevalentemente usata è la M DOBBIAMO ADEGUARCI!!!!!

35 Fase pre-analitica raccolta campione di sangue Perché è meglio la concentrazione mol/l (3.2%) conformità ai metodi di assegnazione ISI conformità agli intervalli terapeutici APTT in terapia eparinica maggiore sensibilità alle carenze fattori coagulazione

36 Fase pre-analitica raccolta campione di sangue Rapporto sangue anticoagulante tradizionalmente 9 (sangue):1(anticoagulante): per volumi di sangue minori la concentrazione di citrato aumenta, il citrato non entra nelle cellule con significativi aumenti dell APTT meno sul PT. Riempire provetta per almeno l 80%. Verificare sempre l assenza di coaguli.

37 Materiali CQI Materiali di controllo: standards liofili a due livelli (normale e patologico) Pool di plasmi freschi congelato Materiali di riferimento: 1) plasmi calibranti commerciali 2) Pool di plasmi freschi congelato

38 Procedure controllo della fase analitica All inizio di ogni giornata lavorativa ed almeno una volta/ciclo Nei laboratori ad elevato carico di lavoro devono essere ripetuti ogni 20 analisi Prima di essere utilizzati i liofili vanno analizzati (20gg in 20 sedute analitiche diverse) per calcolo media e ds

39 Fase post-analitica Variabili Modalità di espressione dei risultati corretta dicitura (per es AT e non AT III) corretta Unità di misura (PT INR e ratio e non %) formulazione diagnostica se necessario Definizione intervallo di riferimento

40 Intervallo di riferimento Ogni laboratorio deve calcolare il proprio intervallo di riferimento (ranges di normalità) analizzando un certo numero (20 soggetti almeno ugualmente suddivisi fra uomini e donne) di campioni prelevati da soggetti sani rappresentativi della popolazione che afferisce al laboratorio. Tali soggetti non devono avere malattie conosciute o assumere farmaci.

41 Intervallo di riferimento L intervallo di riferimento deve essere ricalcolato ogni volta che interviene qualsiasi variazione nel sistema operativo: nuovo strumento nuovo reagente modifiche nella metodica

42 Pool Un pool di plasmi normali serve come standard per esprimere i risultati dei test di laboratorio; per questo motivo deve essere preparato, conservato ed usato seguendo delle procedure ben definite che sono riportate qui di seguito.

43 Preparazione Pool Selezionare un numero di soggetti normali adeguato allo scopo. Eseguire il prelievo di sangue citratato. Centrifugare i campioni con tecnica standard. Separare il plasma dalle cellule, ignorando la parte di plasma a diretto contatto con le cellule (e ricca in piastrine). Trasferire parti uguali del plasma dei soggetti prescelti in un contenitore di plastica e mescolare dolcemente. Dispensare in aliquote (0.5-1 ml), utilizzando provette di plastica dal volume appropriato e con chiusura ermetica (tappo a pressione, o a vite). Durata e temperatura della preparazione Tutte le operazioni (dal prelievo al congelamento devono concludersi entro 3 ore). Per gli scopi piu generali, tutte le operazioni devono essere eseguite a temperatura ambiente (controllata).

44 Conservazione e utilizzo Pool Conservazione Congelare rapidamente il contenuto delle provette immergendole in azoto liquido (o miscela di ghiaccio secco e etanolo). Conservare le provette in congelatore a 70 C. Utilizzo Scongelare poco prima dell uso a temperatura controllata (bagnomaria, 37 C, per 2-3 minuti) e rimescolare dolcemente il plasma prima dell uso. Si esegue il test sul pool indiluito in serie con i campioni dei pazienti e si utilizza per esprimere i risultati di tutti i test classici che prevedono la determinazione di un tempo di coagulazione (PT, APTT, Tempi di Trombina e Reptilase, ecc.). Il risultato puo essere espresso convenientemente in rapporto (tempo-paziente/tempo-pool). Si esegue il test sul pool opportunamente diluito (secondo la metodica) e si utilizza per esprimere i risultati di tutti i test che prevedono la determinazione di un attivita (o concentrazione antigenica) in forma di unita o percentuale (PT, singoli fattori, ecc.).

45 CQI: Livello Normale

46 CQI: Livello Patologico

47 CQI: Pool

48 VEQ: PT secondi

49 VEQ: PT ratio

50 VEQ NEQAS

51 Tipologia richieste esami emostasi afferenti ad un laboratorio generale Screening Pre-operatorio Valutazione Protidosintesi Epatica Controllo Terapie Anticoagulanti (Orale, Raro Eparinica) Diagnosi Malattie Emorragiche Diagnosi Malattie Trombotiche Emergenze Emorragiche

52 SCREENING PRE-OPERATORIO Conta piastrinica PT APTT

53 Malattie epatiche PT (il primo a prolungarsi) APTT (spesso prolungato) Fibrinogeno (tende a diminuire) Conta piastrinca (bassa in concomitanza spesso a ipersplenismo con sequestro plts.)

54 Controllo terapie antitrombotiche PT (pazienti in TAO) APTT (pazienti in terapia eparinica non frazionata, raro) Eparina Xa (solo alcuni pazienti in terapia con LMWH: gravidanze a rischio trombofilico, insuff. renale, grandi obesi)

55 Test di primo filtro della coagulazione Sono le prove minime e sufficienti per consentire un bilancio preoperatorio o un approccio diagnostico alla normalità: Tempo di emorragia Conteggio delle piastrine Tempo di tromboplastina parziale attivato (APTT) Tempo di protrombina (PT) Tripodi A. Linee guida SISET 1998

56 Test di primo filtro TEMPO DI EMORRAGIA test globale di esplorazione della fase vasculopiastrinica alterato nelle PIASTRINOPENIE PIASTRINOPATIE e nelle definito come tempo (minuti) necessario all arresto del sanguinamento provocato da punture o incisioni superficiali eseguite, in condizioni standardizzate, sull avambraccio del paziente.

57 Test di primo filtro TEMPO DI EMORRAGIA influenzato da variabili analitiche e deve essere eseguito con perizia e soprattutto standardizzando scrupolosamente la procedura. metodo Ivy standardizzato: lama da bisturi inserita in un portalama automatico a scatto produce una incisione sulla cute della faccia volare dell avambraccio, mentre a monte con lo sfigmomanometro si esercita una pressione costante di 40 mmhg.

58 Test di primo filtro TEMPO DI EMORRAGIA nell interpretazione tenere sempre presente l influenza dei farmaci che interferiscono con la fase vasculo-piastrinica dell emostasi (per es. aspirina e farmaci antifiammatori non steoridei) tempo normale è < o = a 8 minuti alternativa: PFA-100

59 PFA-100 Utlizza sangue intero attraverso un sistema di capillari Mima la condizione di alto shear stress presente in vivo Sistema rapido, non necessita della presenza del paziente, non è operatore dipendente

60 PFA-100 Il sistema PFA-100 simula la condizione In Vivo Flusso Agonisti Collagene Cartuccia del PFA-100 Tappo Piastrinico

61 PFA-100 Variabili che modificano PFA-100 HB HCT conta plts ASA, FANS ecc.

62 COL/EPI PFA-100 Cartuccia per lo screening Sensibile all ASA, malattia di von Willebrand, difetti piastrinici congeniti, trombocitopenia, basso ematocrito e vari agenti inibitori delle piastrine COL/ADP Utilizzata quando COL/EPI è anormale per discriminare tra disfunzioni indotte da ASA e difetti congeniti il tempo di chiusura è solitamente normale dopo assunzione di ASA

63 Test di primo filtro CONTEGGIO DELLE PIASTRINE indica se il numero delle plts è sufficiente per un emostasi efficace la PIASTRINOPENIA è una delle cause più comuni di sanguinamento fornito dai contaglobuli automatici insieme all emocromo esplora l emostasi primaria (fase vasculopiastrinica) intervallo di riferimento normale per il conteggio: plts/mm 3

64 Test di primo filtro CONTEGGIO DELLE PIASTRINE è importante escludere una pseudopiastrinopenia da EDTA è utile verificare i risultati su striscio di sangue periferico colorato con May Grunwald-Giemsa per avere informazioni su morfologia e distribuzione delle plts

65 PT Tempo in (secondi) necessario affinchè un aliquota di plasma povero di piastrine coaguli in seguito all aggiunta di un estratto tissutale (tromboplastina) e ioni calcio a 37 C. Sensibilità a carenze multiple o isolate di VII, X, V, II e fibrinogeno. VII/VIIa PL, Ca Via estrinseca Danno tessutale Fattore tessutale (TF) Protrombina X V Va PL Ca Xa Via comune Trombina X Fibrinogeno Fibrina

66 Test di primo filtro TEMPO DI PROTROMBINA (PT) tempo in (secondi) necessario affinchè un aliquota di plasma povero di piastrine coaguli in seguito all aggiunta di un estratto tissutale (tromboplastina) e ioni calcio a 37 C. Esplora la via ESTRINSECA

67 Test di primo filtro TEMPO DI PROTROMBINA (PT) PT è prolungato: *carenza dei fattori VII, X, V, II e fibrinogeno *carenza di vit. K *in presenza di eparina *in presenza di anticoagulanti orali *epatopatie

68 PT Procedimento analitico Tempo di coagulazione del plasma citratato povero di piastrine dopo aggiunta di quantità ottimali di estratto tissutale (tromboplastina) e ioni calcio.

69 PT Reagenti Tromboplastina Costituita da fosfolipidi (fosfatidilcolina e fosafatidil-etanolamina) estratti da cervello, placenta o polmoni (umani, di coniglio, bue o scimmia) o di derivazione ricombinante (umana). Le tromboplastine più vicine alla specie umana sono le più sensibili. Alla tromboplastina vengono aggiunti ioni calcio.

70 PT Reagenti Tromboplastina: ISI Per ottenere gli stessi risultati con tutte le varie tromboplastine queste vengono attualmente calibrate contro un riferimento internazionale. Per ognuna di esse viene definito un ISI (indice di sensibilità internazionale) espressione della sensibilità rispetto alla tromboplastina di riferimento.

71 PT Reagenti Tromboplastina: ISI Esistono tre diversi standard internazionali corrispondenti a tre diversi estratti tissutali di origine: umana, bovina e di coniglio. I tre standard attuali sono calibrati contro la standard ancestrale che ha ISI = 1 per definizione. La calibrazione del PT contro gli standard internazionali è a cura del produttore che fornisce valori di ISI al laboratorio per quella tromboplastina.

72 PT Reagenti Tromboplastina: ISI * ISI = international sensitivity index corrisponde allo slope della retta di regressione ortogonale ottenuto confrontando la tromboplastina in uso con lo standard internazionale di riferimento ISI = 1 sensibilità uguale standard internaz. ISI < 1 sensibilità maggiore standard internaz. ISI > 1 sensibilità minore standard internaz.

73 PT Reagenti Tromboplastina: ISI ISI = international sensitivity index sistemi con ISI < o = a 1 sono da preferire Attualmente molte ditte produttrici forniscono valori di ISI specifici delle loro tromboplastine validi per gli strumenti diffusi in commercio si consiglia quindi di usare sistemi (reagente/strumento) con valori di ISI specifico.

74 PT Espressione dei risultati tempo coagulazione (secondi) attività % (estrapolata da una curva dose risposta, allestita con opportune diluizioni scalari NP riportando su un sistema di assi i tempi e le rispettive %) PT ratio (rapporto tempo di coagulazione del plasma da testare e quello di un pool di plasmi normali) INR (International Normalized Ratio) (PT paziente/pt normal pool) ISI

75 PT Espressione dei risultati INR = (PT paziente/pt normal pool) ISI dipende: dalla variabile ISI dalla variabile PT paziente dalla variabile PT normale Validità INR solo nelle seguenti situazioni: pz in TAO per un ambito di coagulazione fra nella fase stabile della terapia

76 PT Espressione dei risultati INR dovrebbe permettere di superare il problema della variabilità dei sistemi di misura e consentire la comparabiltà dei risultati ottenuti in laboratori diversi Esprimere PT in ratio (o secondi e ratio) non in INR in situazioni cliniche al di fuori della TAO in quanto per determinare l ISI si utilizzano plasmi di pazienti in TAO e quindi il valore del ISI che ne risulta può non essere valido per altri difetti.

77 PT Espressione dei risultati in % Questo significa che a livelli alti e a livelli bassi di attività bastano pochi decimi di secondo di differenza nei tempi di coagulazione per leggere percentuali di attività fra loro diverse. Questo comportamento è dannoso. Ad esempio, un valore di 100% può benissimo diventare del 150% solo cambiando il tempo di coagulazione di una frazione di secondo. Quando ciò accade il medico ed il paziente si preoccupano perché nell immaginario collettivo avere un PT corto (percentuale alta) viene interpretato come una tendenza all ipercoagulabilità per la quale non ci sono fondamenti.

78 PT Espressione dei risultati Variabile PT Normale PT normale utilizzato per calcolare il rapporto è una altra delle variabili che possono influenzare la ratio e l INR. Per le linee guida OMS l ideale per ottenere il valore del PT normale è di calcolare la media geometrica di 20 o più soggetti normali determinata con il sistema (lotto reagente e strumento) in uso (MNPT). In alternativa usare il valore di PT in secondi di un pool di plasmi congelato o liofilo

79 PT Espressione dei risultati Variabile PT Normale In alternativa usare il valore di PT in secondi di un pool di plasmi congelato o liofilo. Svantaggi di questi 2 metodi soprattutto del PT normale liofilo è che il valore spesso si discosta dal valore medio della popolazione normale introducendo così una variabile indesiderata nel calcolo dell INR. La media predeterminata oltre che più pratica, avrebbe il vantaggio di rappresentare più fedelmente di quanto non faccia il pool il valore medio della popolazione. Però la media predeterminata avrebbe lo svantaggio di dipendere dal lotto di reagente usato. Ci sono ampie variazioni da lotto a lotto, soprattutto per alcuni reagenti del commercio. Pertanto, sarebbe necessario ricalcolare il valore ad ogni cambio di lotto.

80 PT Espressione dei risultati Variabile PT Normale Il pool giornaliero avrebbe il vantaggio di tenere sotto controllo la variabilità metodologica normalizzando i risultati ottenuti in giorni diversi. Per contro questo vantaggio non sarebbe possibile usando la media di più normali determinata in precedenza che, per definizione, sarebbe sempre la stessa. Considerando i pro e i contro, penso che la scelta più semplice sia l'uso del pool giornaliero che, se preparato e conservato correttamente, è un valore di sicuro riferimento. Se la scelta cade sul pool è opportuno che questo sia analizzato insieme ai campioni dei pazienti in ogni serie analitica.

81 PT Reagenti Sensibilità dei reagenti alle carenze fattoriali I reattivi per la misura del PT devono essere in grado di rilevare carenze del 30% (0,3 U/ml) di fattori della via estrinseca (VII) e comune (II, V, X). Uno studio CISMEL ha dimostrato una buona sensibilità delle varie tromboplastine per i fattori V e X anche a livelli critici di concentrazione del 20-30%; per il fattore II molti reagenti hanno dato risultati falsamente negativi per concentrazioni pari al 25-40%. Per carenze gravi (livelli inferiori al 10%) tutti i reagenti del commercio sono in grado di segnalare l alterazione.

82 HMWK PK XII XI Via intrinseca IX XIIa XIa IXa APTT Tempo (in secondi) richiesto per la formazione del coagulo di fibrina in un campione di plasma citratato, povero di piastrine, per azione di un attivatore della fase di contatto e in presenza di fosfolipidi che simulano quelli piastrinci. VIII VIIIa PL Ca Sensibilità a carenze multiple o isolate di tutti i fattori delle coagulazione eccetto VII e XIII. X Xa X V Va PL Ca Via comune Protrombina Trombina Fibrinogeno Fibrina

83 Test di primo filtro TEMPO TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO (APTT) tempo (in secondi) necessario affinchè un aliquota di plasma povero di piastrine coaguli in seguito all aggiunta di un attivatore della fase di contatto (caolino, ac. ellagico, silice micronizzata), di fosfolipidi in funzione di un sostituto piastrinico e ioni calcio a 37 C. Esplora la via INTRINSECA.

84 Test di primo filtro TEMPO TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO (APTT) APTT è prolungato: *carenza dei fattori precallicreina, chininogeno ad alto peso molecolare, XII, XI, IX, VIII, X, V, II e fibrinogeno *in presenza di anticoagulanti circolanti (LA, anticorpi anti fattore) *in presenza di eparina *in presenza di anticoagulanti orali

85 Test di primo filtro TEMPO TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO (APTT) I valori sono espressi in secondi e in Ratio (per migliorare la comparabilità dei risultati fra i vari laboratori perché tutti i valori vengono corretti contro il plasma di riferimento e l influenza delle variabili, dipendenti dal tipo di reattivo e dalle condizioni di lavoro, viene attenuata). Ratio = rapporto tra l aptt del plasma campione e quello del plasma di riferimento (NP).

86 aptt Procedimento analitico Il plasma citratato, un attivatore di contatto, e dei fosfolipidi (PL) procoagulanti vengono mescolati e incubati a 37 C. L attivatore di contatto attiva i Fattori XI e XII. I PL forniscono la superficie per l interazione dei fattori della coagulazione. Dopo l incubazione viene aggiunta una concentrazione appropriata di Ioni Calcio (gli ioni calcio promuovono l attivazione della via intrinseca della cascata coagulativa) e misurato il tempo di formazione del coagulo.

87 aptt Reagenti Tromboplastina parziale Reagente costituito da fosfolipidi (PL) che simulano quelli piastrinici e da un attivatore della fase di contatto (celite, caolino, ac. ellagico, silice micronizzata) associati in forma liofila o liquida in un unica confezione.

88 aptt Reagenti Tromboplastina parziale Fosfolipidi I fosfolipidi ottenuti per estrazione da organi umani o animali, sono costituiti in opportune concentrazioni da: fosfatidilserina fosfatidilcolina fosfatidil- etanolamina trigliceridi

89 aptt Reagenti Tromboplastina parziale Attivatori fase di contatto Sono sostanze esogene naturali a diverso p.m.: ac. Ellagico celite caolino silice micronizzata

90 aptt Reagenti Tromboplastina parziale Attivatori fase di contatto Ac. ellagico: attivatore rapido, ha il vantaggio, essendo solubile, di assicurare quantità di attivatore uguali ed omogenee ad ogni dosaggio. Caolino, silice, celite: insolubili, tendono a sedimentare, necessitano, pertanto, la riomogenizzazione prima dell uso. Caolino insolubile: dà misure poco riproducibili e non si adatta ad apparecchi di tipo ottico, ma sembra più sensibile al deficit di fattore VIII ed, in assenza di fosfolipidi, alla ricerca LAC.

91 aptt Reagenti Reagente ausiliario Reagente ausiliario è una soluzione di Calcio Cloruro (CaCl2): 0,020 M 0,025 M

92 aptt Reagenti Sensibilità dei reagenti alle carenze fattoriali I reattivi per la misura dell aptt devono essere in grado di rilevare carenze del 30% (0,3 U/ml) di fattori della via intrinseca. Uno studio CISMEL ha dimostrato una buona sensibilità delle varie tromboplastine parziali per i fattori IX, XI, XII anche a livelli critici di concentrazione del 20-30%; per il fattore VIII molti reagenti hanno dato risultati falsamente negativi per concentrazioni pari al 25-40%. Per carenze gravi (livelli inferiori al 10%) tutti i reagenti del commercio sono in grado di segnalare l alterazione.

93 aptt Reagenti Sensibilità dei reagenti al lupus anticoagulant Diversi reagenti aptt presentano diversa sensibilità nei confronti del LA. Ciò dipende dalla potenza dell inibitore e dalla concentrazione e composizione dei PL del reagente. E possibile un aptt normale in presenza di LAC. Variazioni aptt per accrescere la sensibilità coagulativo. del test Diminuzione concentrazione PL vedo inibitori poco potenti. (KCT, DRVVT, SCT) Aumento concentrazione PL sopprimo effetto LA agevolando diagnosi differenziale con altri inibitori. (KCT conferma, DRVVT conferma, SCT conferma)

94 aptt Reagenti Diversa sensibilità diversi reattivi aptt Ac. Ellagico: poco sensibile alle carenze di fattore comprese fra il 30-50%. Insensibile alla carenza di fattore XII. Poco sensibile al LA. Caolino, silice: Più sensibili alle carenze di fattori. Più sensibili al LA. Diversa concentrazione : diversa sensibilità al LA.

95 aptt Suggerimenti NCCLS specifici per l apttl I controlli devono includere un pool di plasmi normali ed un campione anormale. Essi devono essere analizzati all inizio di ogni giornata lavorativa e almeno una volta all inizio di ogni ciclo. Nei laboratori dove c è un elevato carico di lavoro i controlli devono avvenire almeno ogni 20 analisi. In alternativa è sufficiente un re-run di un campione anormale (in quanto più sensibile a identificare i cambiamenti nel sistema) ogni 40 determinazioni.

96 aptt Suggerimenti NCCLS specifici per l apttl Il sistema deve dare risultati anormali con plasmi che hanno attività inferiore al 30% dei fattori VIII, IX, XI, XII e deve essere sensibile all eparina. Tale sensibilità può essere determinata aggiungendo concentrazioni terapeutiche di eparina a plasma normale e determinanado quindi i tempi di coagulazione di ciascun campione.

97 aptt Fonti di errore Le fonti di errore più comune sono: I reagenti contaminati o ricostituiti in maniera errata sia per quanto riguarda il volume sia per quanto riguarda il tipo di diluente. Gli errori nelle condizioni operative (mancato rispetto nei tempi di incubazione, delle variazioni nella temperatura, del ph, della dispensazione dei volumi dei reagenti.

98 aptt Espressione dei risultati I valori sono espressi in secondi e in Ratio (per migliorare la comparabilità dei risultati fra i vari laboratori e nello stesso laboratorio in giorni differenti, perché tutti i valori vengono corretti contro il plasma di riferimento e l influenza delle variabili, dipendenti dal tipo di reattivo e dalle condizioni di lavoro, viene attenuata). Ratio = rapporto tra l aptt del plasma campione e quello del plasma di riferimento.

99 aptt Espressione dei risultati L espressione dei risultati come ratio, sebbene vantaggiosa, perde parte dell efficacia per la mancanza in commercio di un plasma che abbia i requisiti di riferimento. Il pool di plasmi normali congelato a -80 C può essere un riferimento idoneo se costituito da un numero di campioni tale da eliminare la variabilità biologica e l eccessiva oscillazione dei valori nelle varie preparazioni.

100 aptt Espressione dei risultati Intervallo di riferimento: ogni laboratorio dovrebbe costruire il proprio intervallo di riferimento analizzando un numero minimo di 20 campioni prelevati da soggetti sani che non assumono farmaci rappresentativi della popolazione afferente al laboratorio. Sui valori ottenuti deve essere calcolata la media +/- 2 D.S.

101 Test di secondo filtro Se test di primo filtro alterati per giungere all identificazione del difetto: Aggregazione piastrinica Dosaggio Fattori della Coagulazione Studio M. von Willebrand Se test di primo filtro nella norma ma in presenza di una chiara storia clinica positiva per sindrome emorragica: fattore XIII alfa 2 -antiplasmina attivatore tissutale del plasminogeno (t-pa) inibitore dell attivatore tissutale del plasminogeno (PAI-1) tempo di trombina e tempo di reptilase fattore piastrinico 3 (PF3)

102 Cause carenza fattori coagulazione Ridotta sintesi (anomalie quantitative) Sintesi di una molecola anormale (anomalie qualititative) Formazione di anticorpi diretti specificamente contro alcuni fattori (autoanticorpi)

103 Nomenclatura Fattori Coagulazione Fattore fibrinogeno (I) II V VII VIII IX X XI XII XIII Precallicreina (Fletcher) HMWK (Fitzgerald) Conc. necessaria per emostasi normale 100 mg/dl 30-40% 30-40% 30-40% 30-40% 30-40% 30-40% 30-40% 20% non necessario 1% non necessario non necessario

104 Fibrinogeno Glicoproteina che trasformandosi in fibrina per attivazione da parte della trombina permette la formazione del coagulo. Di origine epatica Proteina fase acuta

105 Fibrinogeno Utile nelle seguenti condizioni: afibrinogenemie o disfibrinogenemie congenite o acquisite (epatoma o mieloma) cirrosi epatica malattie infiammatorie, autoimmuni CID valutazione rischio trombotico

106 Disfibrinogenemia Anomalia molecolare del fibrinogeno autosomica dominante (le mutazioni conducono all alterazione di singoli aminoacidi in una delle tre catene del fibrinogeno). Caratterizzata da una discrepanza fra i livelli funzionali di fibrinogeno (ridotti) e i livelli antigenici (normali o aumentati).

107 Disfibrinogenemia Test primo filtro nella norma Pazienti affetti disfibrinogenemia: evento emorragico, evento trombotico, nessun evento Diagnosi laboratorio: tempo di trombina (TT) e tempo di reptilase Questi test esplorano la reazione di conversione di fibrinogeno in fibrina TT è sensibile anche all eparina quindi l uso combinato dei due test permette di differenziare situazioni in cui TT è prolungato per presenza di eparina (tempo reptilase nella norma)

108 Metodi dosaggio fibrinogeno Metodo immunologico: immunodffusione radiale in piastre agar. Da usare SOLO nello studio delle disfibrinogenemie, dove in presenza di ridotto fibrinogeno funzionale è presente una normale concentrazione di fibrinogeno Ag. Metodo derivazione PT in molti strumenti il fibrinogeno è calcolato utilizzando la curva del PT. Infatti il valore è ricavato misurando il delta fra l inizio e la fine della formazione del coagulo

109 Metodi dosaggio fibrinogeno Metodo secondo Clauss consente di quantificare il fibrinogeno realmente funzionante. in largo eccesso di trombina la velocità della reazione di coagulazione dipende solo dalla concentrazione del fibrinogeno.

110 Dosaggio fattori coagulazione Principio del metodo: valutazione del grado di correzione del tempo di coagulazione operato dal plasma in esame su un plasma carente del corrispondente fattore. PT per i fattori: VII, V, II, X APTT per i fattori: VIII, IX, XI, XII il grado di correzione si esprime in % procoagulante curva di riferimento (scala bilog)

111 Factor Assays Extrinsic Proteins II, V, VII, X Plasma with 0% F.VII has a Prolonged Prothrombin Time By adding various concentrations of Factor VII Standard the Prothrombin Time is corrected The degree of correction is proportional to the concentration 0.1 ml F.VII Deficient Substrate 0.1 ml F.VII Standard or patient s plasma dilution 0.2 ml Thromboplastin Calcium Chloride Mixture

112 Factor Assays Intrinsic Proteins VIII, IX, XI, XII Plasma with 0% Factor VIII has a prolonged APTT 0.1 ml Factor VIII Deficient Plasma 0.1 ml Phospholipid and Activator By adding various concentrations of Factor VIII Standard the APTT is shortened 0.1 ml Factor VIII Standard or patient s plasma dilution The degree of correction is proportional to the concentration 0.1 ml Calcium Chloride

113 The Standard Curve Dilution % Activity Clotting Time 1:5 20.0% 14.3 seconds 1: % 17.3 seconds 1:20 5.0% 21.0 seconds 1:40 2.5% 26.0 seconds