CORSO DI LAUREA FARMACIA E C.S.F. ANALISI BIOCHIMICO CLINICHE. cap. 1 TECNICHE ANALITICHE PRINCIPALI

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1 CORSO DI LAUREA FARMACIA E C.S.F. ANALISI BIOCHIMICO CLINICHE A.A G.F. CORTELLI cap. 1 TECNICHE ANALITICHE PRINCIPALI A.A G.F. CORTELLI 1

2 PRINCIPALI TECNICHE ANALITICHE 1. SPETTROFOTOMETRIA a. di emissione (a fiamma) b. assorbimento atomico c. UV e visibile 1 a. Spettrofotometria di emissione (a fiamma) PRINCIPIO: un corpo solido, portato all incandescenza per assorbimento di energia termica o elettrica, emette uno spettro continuo a diverse lunghezze d onda. APPLICAZIONE: fotometri a fiamma per la determinazione di Na, K, Li (tale metodo, nella AUTOMAZIONE della chimica clinica, è stato sostituito da ELETTRODI SPECI- FICI e SELETTIVI per i singoli ioni, incorporati in Moduli separati, ma inseriti nel sistema analitico automatizzato MODULI ISE) 2

3 1 a. Spettrofotometria di emissione (a fiamma) Fotometri a fiamma per la determinazione di metalli alcalini e alcalino terrosi 1 b. Spettrofotometria ad assorbimento atomico PRINCIPIO: un elemento in un dato stato fisico, può assorbire le stesse radiazioni elettromagnetiche che emetterebbe se, nel medesimo stato, venisse eccitato (Principio di Kirchof). Il sistema è paragonabile alla Spettrofotometria UV / Visibile, ma con elementi di determinazione e lettura diversi. APPLICAZIONE: impiegato per la determinazione di metalli pesanti (Piombo, Cadmio, Zinco, Selenio ) 3

4 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (1) PRINCIPIO: avvenuta la reazione specifica (enzimatica o colorimetrica) si forma una soluzione in grado di assorbire (ad una caratteristica lunghezza d onda) una quantità di luce monocromatica proporzionale alla quantità di analita presente nel prodotto di reazione. La quantità di luce assorbita sarà l indice della concentrazione dell analita. Lo Spettrofotometro è composto da: - Sorgente luminosa - Monocromatore (filtri interferenziali o prisma) - Cuvetta di lettura - Fotomoltiplicatore o fotocellula 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (2) Nei moderni Analizzatori automatizzati per la grossa routine il monocromatore (filtro o prisma) è posto dopo la cuvetta di lettura, cosicchè - si possono leggere più lunghezze d onda comprese tra 340 e 600 nm. - si possono applicare sistemi di misura in bicromatismo - si possono calcolare indici di sottrazione per sieri lipemici, itterici o emolitici (modalità LIH) 4

5 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile 5

6 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile PIATTI REATTIVI E CUVETTE DI REAZIONE 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile AU 5400, OLYMPUS 6

7 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (3) BICROMATISMO: è una tecnica che, impiegando 2 filtri di lettura (a due lunghezze d onda diverse, una principale e una secondaria), può leggere simultaneamente l assorbimento del campione (prodotto di reazione) e l assorbimento di eventuali interferenze, dovute per esempio a torbidità, o presenza di bolle nella cuvetta di reazione, o variazioni di intensità luminosa Avverrà allora una compensazione ed il valore della seconda lettura sarà sottratto al valore ottenuto con il filtro principale. Teoricamente l assorbimento letto con il filtro secondario dovrebbe essere pari a zero, ma ciò non avviene, per le molte variabili a cui è soggetta la lettura di una reazione. 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (4) / / / lettura del bianco reattivo + siero (noise, rumore di fondo) [C] lettura del prodotto di reazione risultante dopo sottrazione del noise: valore definitivo (vero) T (sec) e Pt. di lettura 7

8 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (5) VARIABILI da considerare nella valutazione di un metodo spettrofotometrico e/o di uno strumento: - SENSIBILITA (dipende dal metodo) - PRECISIONE (dipende dallo strumento) - ACCURATEZZA (dipende dal metodo) - LINEARITA (dipende dal metodo) 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (6) - 1) SENSIBILITA : non dipende dallo strumento ma è legata al metodo ed alla sua capacità di dosare piccole quantità del componente studiato; NON ha un valore numerico. Con il termine di LIMITE DI RILEVABILITA si intende la più piccola quantità di sostanza che il metodo riesce a dosare (cioè a distinguere dal bianco, posto = allo 0 teorico). Dal punto di vista strumentale può anche venir definito come un rapporto tra il segnale analitico e il segnale di fondo ( rumore / noise ). 8

9 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (6/1) - 2) PRECISIONE : è la CONCORDANZA fra i risultati di una serie di distinte misure, ottenute con lo stesso metodo su uno stesso campione. Essa dipende dallo STRUMENTO ed in particolare da: - SELEZIONE DELLA LUNGHEZZA D ONDA - REGOLAZIONE DELLO ZERO DELLO STRUMENTO - TEMPERATURA DI REAZIONE - DISPENSAZIONE DEL CAMPIONE E DEI REATTIVI - 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (6/2) - PRECISIONE: per verificare la precisione di un metodo analitico (o di uno strumento) si procede alla lettura consecutiva di una serie di almeno 20 frazioni dello stesso campione, ripetuta in un unica seduta analitica e, successivamente, in giornate diverse. La distribuzione dei risultati ottenuti viene rappresentata graficamente con una CURVA A CAMPANA detta CURVA DI GAUSS (o curva degli errori). Lo zero dello strumento viene verificato periodicamente mentre le altre variabili (lunghezza d onda, temperatura di reazione, aghi di dispensazione siero / reattivi, lampada) vengono standardizzate con tarature sistematiche (con standard specifici) o con controlli periodici della temperatura, dello stato degli aghi (MANUTENZIONE) 9

10 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (7/1) - 3) ACCURATEZZA: dipende dalla specificità del metodo: essa è il grado di concordanza tra il valore medio trovato e il valore vero conosciuto; anche l accuratezza si riferisce di solito ad una serie di risultati ottenuti in condizioni stabilite e non ad un singolo risultato. - SPECIFICITA : non può essere disgiunta dall accuratezza: essa è la proprietà del metodo di dosare solo ed interamente la sostanza studiata, senza subire interferenze da parte di altre sostanze presenti nel composto. Se la specificità non è soddisfacente bisogna cercare un altro metodo (es. enzimatico anziché colorimetrico ) 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (7/2) SPECIFICITA : essa, così come l accuratezza, può quindi essere influenzata da molte cause: - REATTIVI - STRUMENTI - COMPOSIZIONE DEL CAMPIONE - ANALITI - MANUTENZIONE - 10

11 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (8) - 4) LINEARITA :dipende dalla metodica impiegata e non dalla strumentazione; graficamente essa viene rappresentata dalla deviazione della LEGGE DI LAMBERT-BEER per alte concentrazioni di analita nella sostanza in esame. La legge di L.-B. risulta valida per soluzioni o diluite, o che comunque siano dentro ad ambiti adatti di concentrazione, e qualora si usino radiazioni monocromatiche. 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (9/1) Tutti i parametri visti possono essere influenzati da altri fenomeni, che possono interferire sulla determinazione indipendentemente dallo strumento o dal reattivo usato. Essi sono: - CARRY OVER - INTERFERENZE 11

12 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (9/2) - CARRY OVER: si riferisce al dosaggio di uno stesso analita ed è un fenomeno di TRASCINAMENTO che si può avere a causa di un ago di campionamento non ben lavato tra una dispensazione e l altra e che perciò rimane inquinato, oppure quando la cuvette di lettura è stata precedentemente impiegata per il dosaggio di un analita a concentrazione molto alta. SOLUZIONE DEL PROBLEMA: lavaggi prolungati degli aghi, e manutenzione puntuale dello strumento. 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (9/3) - INTERFERENZA: riferito al dosaggio di analiti diversi, si verifica quando nella stessa cuvetta vengono dosati in successione, analiti i cui reattivi o le cui sostanze endogene del siero stesso possono dare reazioni interferenti. SOLUZIONE DEL PROBLEMA: lavaggi prolungati ed eventuale spostamento dei reattivi di un determinato analita interferente in una posizione (canale) diversa. 12

13 1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (10) Curva di una reazione enzimatica (crescente) cinetica e misurazione dell intervallo fra due punti della reazione (con bireattivo) PRINCIPALI TECNICHE ANALITICHE 2. TURBIDIMETRIA 3. NEFELOMETRIA PRINCIPIO: Il fondamento delle tecniche turbidimetriche e nefelometriche è la misura della luce assorbita o diffusa da parte di un sistema eterogeneo quale può essere una soluzione colloidale o un precipitato finemente disperso. 13

14 2.3. TURBIDIMETRIA / NEFELOMETRIA (2) EFFETTO TYNDALL : quando un raggio di luce attraversa un sistema contenente una fase dispersa, si può avere sia ASSORBIMENTO di una parte della luce, sia DIFFUSIONE della luce stessa (per una serie di processi di riflessione, di rifrazione e di diffrazione). I due fenomeni sono in realtà sempre presenti, ma il loro contributo risulta molto differente, a secondo delle dimensioni delle particelle presenti in sospensione. Quando prevale il fenomeno di assorbimento (sospensione di particelle grandi rispetto la usata per la misura) conviene usare misure turbidimetriche. - Quando invece la sospensione è molto fine, è preferibile la misura nefelometrica TURBIDIMETRIA / NEFELOMETRIA (3) Entrambe le tecniche vengono attualmente usate in chimica clinica, per rilevare proteine ANTIGENI: Ag del siero, che hanno reagito con ANTICORPI SPECIFICI: Ab formando particelle dello stesso diametro: Ag Ab che creano una torbidità nella soluzione finale. Le difficoltà da superare per la standardizzazione della turbidimetria in chimica clinica erano dovute alle diverse dimensioni delle particelle, alle diverse lunghezze d onda ( ) impiegate, ai tempi di lettura differenti. Con l alta tecnologia odierna, molti problemi sono stati superati (es. con aggiunta di colloidi protettori, standardizzazione dei tempi di lettura, formazione di sospensioni stabili e riproducibili, letture a lunghezze d onda attorno a 500 nm ) percui i metodi turbidimetrici vengono attualmente adottati anche sulla strumentazione automatizzata della grossa ruotine. 14

15 2.3. TURBIDIMETRIA / NEFELOMETRIA (4) TURBIDIMETRIA: per la lettura in turbidimetria è sufficiente uno spettrofotometro e grazie al progresso tecnologico oggi è possibile utilizzare questa metodica anche con la strumentazione automatica per la grossa routine in chimica clinica; vengono così eseguiti i dosaggi della maggior parte delle proteine. NEFELOMETRIA: tale tecnica rimane adatta per la determinazione di fasi disperse molto fini (effetto Tyndall apprezzabile) e servono strumenti dedicati; la misura della luce difratta dalle particelle si esegue ad angolo retto rispetto alla direzione della luce incidente. Oggidì solo le proteine più nobili vengono eseguite con questa tecnica (immunoglobuline, aptoglobina ) 15

16 4. SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA (1) Si applica per la determinazione di analiti che, dopo una reazione chimica, formano una sostanza colorata sopra una striscia reattiva (CHIMICA SECCA O DRY CHEMI- STRY) oppure per la lettura di strisce, ove è stata fatta una separazione di varie fasi, successivamente colorate (ELETTROFORESI). PRINCIPIO: si basa sulla variazione dell intensità luminosa della luce riflessa (ad una specifica lunghezza d onda) da una superficie dove è avvenuta una reazione chimica. 4. SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA (2) ESEMPI DI APPLICAZIONE: - Dosaggio del glucosio in pazienti diabetici - Dosaggio semiquantitativo per esame chimico urine - Dosaggio quantitativo di vari analiti nel sangue (Dry chemistry) - Determinazione del profilo proteico dopo separazione elettroforetica - Determinazione di alcuni analiti presso Studi Medici - Determinazione di alcuni analiti in Veterinaria 16

17 4. SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA (3) DRY CHEMISTRY (1) Determinazione quantitativa di analiti in Dry Chemistry: la tecnica (sviluppata dalla Kodak) e adattata a strumentazione di laboratorio per grossa routine viene impiegata largamente in U.S.A. per l esecuzione del test al letto del paziente e per il POINT OF CARE TESTINTG (P.O.C.T.) La tecnica si basa su LASTRE a vari strati (5) 1) Strato di diffusione: ha una porosità isotropica (con proprietà fisiche costanti indipendenti dalla direzione) e serve per distribuire uniformemente il campione sulla superficie della lastra trattenendo molecole, quali proteine, lipidi e pigmenti del siero. 4. SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA (4) DRY CHEMISTRY (2) 2) Strato di Reagenti: su di esso sono presenti i reagenti specifici (completi o parziali) e qui avviene la reazione (finale o parziale), prima del passaggio alla successiva membrana. 3) Membrana semipermeabile: essa consente il passaggio del solo prodotto intermedio di reazione. 4) Strato indicatore: contiene il reattivo finale che porta al colore. 5) Supporto trasparente: è costituito da una pellicola trasparente attraverso la quale viene effettuata la lettura fotometrica (per riflessione). 17

18 4. SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA (5) DRY CHEMISTRY (3) Determinazine semiquantitativa in Dry Chemistry: l applicazione più diffusa è quella delle striscie reattive per la determinazione dei caratteri chimici delle URINE. Procedimento: una goccia di campione (urina) reagisce su un supporto imbevuto del reattivo specifico; la colorazione che si forma è letta per riflessione mediante l uso di fibre ottiche, mentre l intensità del colore sarà proporzionale alla concentrazione dell analita. 4. SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA (6) DRY CHEMISTRY (4) Gli analiti dosati (semiquantitativamente) sono: ph Emoglobina Glucosio Acetone Proteine Pigmenti biliari Urobilinogeno Nitriti Peso specifico (in rifrattometria) 18

19 4. SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA (7) DRY CHEMISTRY (5) Vantaggi della Chimica Secca (Dry Chemistry): Più agevole lo smaltimento dei rifiuti (solo solidi) Rapidità di esecuzione e di ottenimento del dato analitico Svantaggi della Chimica Secca (Dry Chemistry) per le determinazioni quantitative: Poche Ditte sul mercato (Kodak,Dasit), perciò: monopolio Rigidità delle calibrazioni, per ogni serie di lastre Sistema rigorosamente chiuso 5. TECNICHE ELETTROFORETICHE (1) PRINCIPIO: si sfrutta la migrazione di macromolecole, dotate di carica elettrica, poste in un mezzo liquido, sotto l influenza di un campo elettrico. In campo biochimico, la principale applicazione è rappresentata dallo studio quantitativo o semiquantitativo delle proteine seriche. Due sono le principali tecniche usate nei laboratori: - ELETTROFORESI ZONALE - ELETTROFORESI CAPILLARE 19

20 5. TECNICHE ELETTROFORETICHE (2) ELETTROFORESI ZONALE: I componenti sono: 1) SUPPORTO SOLIDO INERTE 2) DEPOSITORE DEL CAMPIONE 3) VASCHETTA DI MIGRAZIONE 4) VASCHETTE DI COLORAZIONE 5) RIFLETTOMETRO PER LA LETTURA 5. TECNICHE ELETTROFORETICHE (3) SUPPORTO INERTE: deve essere permeabile alla sostanza da separare e non interferire nella reazione di separazione; può essere: carta da filtro, gel di amido, acetato di cellulosa, gel di agarosio o di poliacrilamide. DEPOSITORE DEL CAMPIONE: con questo dispositivo si compie l unica operazione non automatizzata dell intero processo; a seconda del supporto usato, la quantità di campione varia da 2 a 50 O VASCHETTA DI MIGRAZIONE: contiene la soluzione tampone (a ph 8.6), nella quale vengono immerse le due estremità della striscia. Viene poi applicata una differenza di potenziale con una tensione costante di V, per circa 20 (per tempi più lunghi: effetto Joule), per permettere alle proteine di migrare a velocità diversa a seconda della loro diversità di carica,verso il catodo o verso l anodo. 20

21 5. TECNICHE ELETTROFORETICHE (4) VASCHETTE DI COLORAZIONE: i coloranti possono essere: amido Schwatz, rosso Ponceau, blue di bromocresolo, verde di bromofenolo, sudan nero, red oil (per lipoproteine), reattivo di Schiff (per glicoproteine) RIFLETTOMETRO: prima della lettura, il supporto deve essere diafanizzato, ponendolo su una lastrina di vetro in stufa a 40 circa per 20 ; poi con il riflettometro si misura l assorbanza delle bande colorate tramite un fascio di luce a lunghezza d onda ( ) adatta a seconda del colorante usato e si ottiene un tracciato elettroforetico. 5. TECNICHE ELETTROFORETICHE (5) ELETTROFORESI ZONALE (classica) elettrodi supporto (es. acetato di cellulosa) vaschette con tampone differenza di potenziale supporto di acetato di cellulosa 21