Apoptosi. Ø é un suicidio che implica una reazione attiva della cellula

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Viviana Tonelli
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1 Apoptosi

2 Apoptosi Ø é un suicidio che implica una reazione attiva della cellula Ø può verificarsi sia in seguito a stimoli esterni (agenti chimici, fisici, ormoni, citochine, farmaci) che a stimoli endogeni (turnover cellulare, differenziamento terminale, rimodellamento durante sviluppo e morfogenesi)

3 Evoluzione dell apoptosi v L apoptosi esiste in tutti gli organismi pluricellulari v Organismi monocellulari: presente in forme piú o meno simili anche nei batteri, forse in difesa contro infezioni virali (che a loro volta hanno escogitato numerosi mezzi per inattivare il programma apoptotico endocellulare)

4 Peculiarità del processo apoptotico: Ø una cascata di reazioni si susseguono in un ordine stereotipato al fine di terminare la vita cellulare Ø molte di queste reazioni sono bloccabili in punti ben precisi sia dall esterno (agenti farmacologici o inibitori di natura sintetica) che dall interno (modulazione di geni endogeni) Ø i residui cellulari restano vengono eliminati rapidamente da fagociti, professionali e non, evitando l innesco di una reazione infiammatoria

5 Un problema esistenziale: Perché una cellula dovrebbe suicidarsi?

6 A volte la morte cellulare rappresenta un evento positivo per l organismo 1. L apoptosi é richiesta per un normale sviluppo embrionale 2. L apoptosi é necessaria per la distruzione di cellule che rappresentano una minaccia per l integritá dell organismo

7 Apoptosi, sviluppo embrionale e differenziamento v Metamorfosi: il riassorbimento della coda del girino v Sviluppo: apoptosi delle cellule occupanti lo spazio interdigitali, formazione delle appropriate sinapsi neuronali; v Differenziamento: turnover fisiologico delle cellule mature in tessuti continuamente proliferanti (p.es., cellule intestinali, neutrofili)

9 Apoptosi e difesa dell organismo v Contro cellule infettate da virus (ad opera di linfociti T citotossici); v Contro cellule del sistema immune autoreattive; v Contro cellule in cui si verifica un danno al DNA; v Contro cellule tumorali.

11 Caratteristiche morfologiche dell apoptosi Ø Diminuzione del volume cellulare (perdita di liquidi intracellulari per processi attivi mediati dalle pompe di membrana) Ø Condensazione e marginalizzazione della cromatina e frammentazione della stessa Ø Formazione di protuberanze (blebs) citoplasmatiche, delimitate da membrana (esposizione di PS) e contenenti frammenti di cromatina condensata e di organelli cellulari -> corpi apoptotici

12 La cellula in apoptosi subisce modificazioni morfologiche e biochimiche che portano alla sua frammentazione e ne favoriscono la fagocitosi

13 Normal Cell Cell shrinkage away from neighbouring cells Plasma membrane blebbing Cytoplasmic and nuclear condensation Margination of condensed chromatin Nuclear and cellular fragmentation Apoptotic Bodies Phagocytosis

14 h)p://research.yale.edu/ysm/ar6cle.jsp?ar6cleid=357

16 La scale)a di DNA frammentato di una cellula apopto6ca

17 Differenze morfologiche fra apoptosi e necrosi Membrane breaks down resulting in an inflammatory response! Edema! Membrane intact until phagocytosed! Pyknosis!

18 Morphological Differences between Apoptosis and Necrosis Apoptosis vs Necrosis Nuclei Cytoplasmic Organelles Cell Membrane Cell Volume In Tissues Dense Condensation of Chromatin Morphologically Intact Apoptotic Bodies, Blebbing Cells shrink Single Cells Affected Irregular Chromatin Clumping Disrupted Blebbing and Loss of integrity Cells swell Groups of Cells Affected Tissue Response None Inflammation

19 Necrosi vs apoptosi Distruzione causata da una bomba (Nagasaki, 1945) Demolizione di un rudere

20 Che cosa succede quando l apoptosi non funziona?

21 Il KO per Apaf- 1 arresta lo sviluppo embrionale

22 Mancanza di apoptosi interdigitale

23 Mancanza di auvazione della caspasi 3

24 Diminuita apoptosi in vitro di cellule Apaf- 1 - /-

25 Syndactlyly (1/2500 births) h)p://en.wikipedia.org/wiki/webbed_toes h)p://

27 Ruolo dell apoptosi nella tumorigenesi Aumento della sopravvivenza cellulare e riduzione dell apoptosi nell oncogenesi mutatazione di geni oncosoppressori p53 (50% dei tumori umani ) Iperespressione di Bcl-2 in alcune leucemie and linfomi B. Perdita di espressione del fattore attivante l apoptosi (Apaf-1) nel melanoma

28 Malattie Associate a deregolazione dell Apoptosi Aumento Apoptosi AIDS Malattie Neurodegenerative malattia di Alzeheimer, Morbo di Parkinson, Malattia di Huntington Inhibizione Apoptosi Cancro linfoma Follicolare carcinomi con mutazione di p53 Malattie Autoimmuni Lupus erytematoso Sistemico Infectioni Virali Herpesvirus, poxvirus, adenovirus

29 Ruolo dell apoptosi nelle Malattie Neurodegenerative Apoptosi fisiologica durante lo sviluppo embrionale del cervello innescata dall assenza di fattori di crescita Tossicità di aggregati di proteine con anomalie strutturali possono innescare apoptosi nella malattia di Alzeheimer, nel morbo di Parkinson, nella malattia di Huntington (Caspasi 9 attivata nel cervello degli alzheimeriani) amyloid-β Aggregati -Huntington IC Ca 2+ Oxidative stress Neuronal Receptors FADD/ Caspase 8 Apoptosis Apoptosis

30 Apoptosis is a balancing act Too much: - Alzheimers - Parkinson s - Hun6ngton s - AIDS - stroke Too li)le: - cancer - autoimmunity - persistent infec6ons

31 Le fasi del programma apoptotico 1. Decisione se iniziare o meno la procedura di suicidio cellulare 2. Passaggio del punto di non ritorno ( commitment ) 3. L esecuzione

32 Via intrinseca Via estrinseca

33 La decisione ed il passaggio del punto di non ritorno v Proteine regolatorie hanno il compito di integrare i segnali pro- ed anti-apoptotici, e a seconda delle circostanze intra- ed extra-cellulari avviare o meno l esecuzione 1. Adattatori, in grado di trasdurre direttamente segnali apoptotici agli esecutori 2. Regolatori della funzionalitá mitocondriale (membri della famiglia Bcl-2)

34 Il mitocondrio Ø Fasi precoci -> mantenimento della funzionalità mitocondriale Ø Rilascio di proteine normalmente residenti all interno del mitocondrio (citocromo c, Smac, HtrA2/Omi, AIF) Ø Caduta del potenziale di membrana mitocondriale e perdita della permeabilità della stessa (caspasimediata) Ø Collassamento e/o fissione dei mitocondri

35 Il citocromo c Ø normalmente risiede nello spazio fra la membrana interna ed esterna mitocondriale e funziona nel pathway respiratorio mitocondriale Ø viene rilasciato dai mitocondri nel cytosol dopo stimoli apoptotici Ø forma un complesso con Apaf-1 (l omologo di Ced-4) e procaspasi 9 (inattiva) in presenza di ATP -> apoptosoma, che porta ad autoattivazione della procaspasi 9 -> innesco della fase di esecuzione Ø il rilascio precede i cambiamenti morfologici, è un fenomeno del tipo tutto-o-nulla ed è rapidissimo e sincrono (meno di 5 minuti) Ø varie ipotesi per la via d uscita: Bax-channels, megacanale mitocondriale (o PTP, permeability transition pore)

39 apoptosoma Apaf-1 WD-40 Repeats CARD CED-4 datp dadp Apaf-1 unfolding * cytochrome c Pro-caspase-3/-7 Pr o L S * * * * Active caspase-3/-7 S L CARD CARD L S Pro-caspase-9 Active caspase-9

40 v Smac/Diablo v HtrA2/Omi Altre proteine rilasciate dal mitocondrio v AIF: proteina dello spazio intermembrana -> nucleo -> cambiamenti nella morfologia nucleare associati all apoptosi (caspasi-indipendente) Coinvolto nell apoptosi solo in seguito a particolari stimoli (necessario per la cavitazione nei primi stadi embrionali) v EndoG: proteina dello spazio intermembrana -> nucleo -> cambiamenti nella morfologia nucleare associati all apoptosi

41 CITOPLASMA NUCLEO ICAD ICAD CAD CAD Frammentazione DNA caspasi- 3 EndoG HMW + oligonuclosomi AIF Condensazione croma6na +HMW

42 Le molecole chiave dell apoptosi v P53 v Caspasi v Bcl2 family v IAP family v Death Receptors

43 caspasi Ø Cisteina aspartato-specifiche proteasi Ø superfamiglia di 12 membri (nell uomo) Ø alto grado di omologia delle varie caspasi Ø conservazione e aumento della complessità durante l evoluzione: 3 caspasi in c.elegans (Ced-3 prima caspasi identificata), 4 in drosophila, 12 in roditori e uomo

44 Caratteristiche biochimiche delle caspasi Ø sito attivo ben conservato QAC ys285 XG Ø assoluta richiesta di aspartico (D) in P 1 del substrato Ø suddivisione in base alla sequenze peptidica preferenziale di clivaggio: - gruppo I: caspasi-1, -4, -5, motivo WEHD - gruppo II: caspasi-2, -3, -7, motivo DXXD - gruppo III: caspasi-6, -8, -9, -10, motivo I/L/V/EXD

45 Esistono diversi =pi di caspasi con diversa funzione caspasi iniziatrici: si sono evolute per collegare distinte pathway di segnalazione a monte con pathway esecutrici a valle -> hanno un lungo prodomain contenente moduli caratteristici per l interazione proteina-proteina. Sono in grado di autoattivarsi caspasi esecutrici: processate ed attivate dalle caspasi iniziatrici. Caratterizzate da un prodomain breve.

46 Asp Asp Asp prodomain LARGE subunit linker SMALL subunit 1. taglio tra subunità maggiore e minore (2-step) 2. separazione del prodomain dalla subunità maggiore 3. caspasi attiva: omodimero composto da due monomeri, ciascuno composto da una subunità maggiore e una minore v auto-attivazione v trans-attivazione v attivazione da altre proteasi (tra cui caspasi stesse)

47 1. taglio tra subunità maggiore e minore (2-step) 2. separazione del prodomain dalla subunità maggiore 3. caspasi attiva: omodimero composto da due monomeri, ciascuno composto da una subunità maggiore e una minore

48 Caspasi: ruolo nella esecuzione del programma apoptotico! La proteolisi è responsabile delle alterazioni morfologiche che caratterizzano la morte cellulare apoptosica.! Blocco delle attività delle caspasi (mutationi o inhibitori) ritarda o previene la morte cellulare apoptosica. "

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