Ingegneria animale: principi di base. Sara Della Torre Adriana Maggi Lab
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1 Ingegneria animale: principi di base Sara Della Torre Adriana Maggi Lab
2 Manipolazione genetica tradizionale
3 Manipolazione genetica moderna DNA RICOMBINANTE
4 Cosa mancava per passare dalla manipolazione genetica tradizionale a quella moderna? 1967: Scoperta della DNA ligasi 1968: Scoperta degli enzimi di restrizione 1972: Avanzamenti nelle tecniche di trasferimento del DNA e nell uso di plasmidi
5 DNA hybridization, 1961 Double helix Watson and Crick, 1953 PCR Kary Mullis,
6 Animale Transgenico: animale nel cui genoma è stato inserito uno o più frammenti di DNA esogeno Transgene: frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali
7 Organismi utilizzati come modelli transgenici: Arabadopsis (plant) C. elegans Fruit flies Xenopus (rana) Zebrafish Topo Ratto Maiale Pecora Capra Mucca
8 Tipi di transgene Piccole molecole di DNA ricombinante geni o cdna legati a sequenze di DNA che permettono la corretta espressione da parte della cellula ospite Construtti Reporter promoter del gene desiderato legato ad una cassetta di espressione la cui presenza può essere facilmente rilevata; es.: GFP, lacz, luciferasi Grandi molecole di DNA yeast artificial chromosomes (YACs) o bacterial artificial chromosomes (BACs)
9 Metodi di Ingegneria animale
10 Metodi principali di ingegneria animale Transgenesi standard Gene targeting Transgenesi condizionale Clonazione
11 Transgenesi standard Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata SCOPO: Guadagno di funzione CARATTERISTICA: inserzione random, casuale
12 Introduzione di una sequenza di DNA purificata in uno dei due pronuclei della cellula uovo fecondata
13 Transgenesi standard Work flow 1 Preparazione degli oociti fecondati 2 3 Preparazione dei costrutti Preparazione delle femmine pesudogravide Microiniezione e trasferimento nelle femmine pseudogravide 4 Screening della progenie
14 Transgenesi standard Work flow: STEP1 1 Preparazione degli oociti fecondati Cocktail ormonale per la superovulazione: PMS (pregnant mares serum) HCG (human chorionic gonadotropin) Accoppiamento Raccolta degli oociti fecondati
15 Transgenesi standard Work flow: STEP2 2 Preparazione dei costrutti Costruzione del transgene Amplificazione del transgene Purificazione del transgene
16 Transgenesi standard Work flow: STEP3 3 Preparazione delle femmine pesudogravide Microiniezione e trasferimento nelle femmine pseudogravide Accoppiamento delle femmine con maschio vasectomizzato vasectomizzato
17 Transgenesi standard Work flow: STEP3 3 Preparazione delle femmine pesudogravide Microiniezione e trasferimento nelle femmine pseudogravide
18 Transgenesi standard Work flow: STEP3 3 Preparazione delle femmine pesudogravide Microiniezione e trasferimento nelle femmine pseudogravide Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell utero di femmina pseudogravida X pseudogravida
19 Transgenesi standard Work flow: STEP4 4 Screening della progenie Estrazione DNA dalle code della progenie Analisi tramite PCR M C Analisi tramite Southern-blot C
20 Transgenesi standard Efficienza
21 Transgenesi standard Applicazioni: animali come bioreattori
22 Transgenesi standard Vantaggi e svantaggi Metodo più utilizzato per produrre topi transgenici. L inserzione del transgene è casuale; non si sa dove si è localizzato il transgene; Non si può regolare il numero di copie introdotte nel pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per l integrazione; Bassa efficienza
23 Gene Targeting Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells SCOPO: perdita o modifica di funzione CARATTERISTICA: inserzione mirata
24 Gene Targeting Meccanismo: ricombinazione omologa AGGTGCCTGACT X AGGTGCCTGACT Gene inattivo TTCAGCCGATCCA X TTCAGCCGATCCA AGGTGCCTGACT Gene inattivo TTCAGCCGATCCA
25 Gene Targeting
26 Gene Targeting Meccanismo di selezione positiva e negativa
27 Gene Targeting
28 Gene Targeting Work flow 1 Preparazione delle cellule ES pluripotenti Trasfezione 2 Selezione delle cellule ES 3 Iniezione delle cellule ES trasfettate in una nuova blastocisti 4 Screening della progenie
29 Gene Targeting Work flow: STEP1 1 Preparazione delle cellule ES pluripotenti Trasfezione Preparazione delle ES pluripotenti dalla blastocisti Preparazione del transgene Tk - thymidine kinase Gene non attivo Sequenze di ricombinazione Omologa Neo r resistenza alla Neomicina Elettroporazione
30 Gene Targeting Work flow: STEP2 2 Selezione delle cellule ES Tk - thymidine kinase Gene non attivo Sequenze di ricombinazione Omologa Neo r resistenza alla Neomicina Trattamento con neomicina e ganciclovir No integrazione X Integrazione sito-specifica (1/1000) Integrazione random X
31 Gene Targeting Work flow: STEP3 3 Iniezione delle cellule ES trasfettate in una nuova blastocisti ES inserite in una blastocisti di topo agouti
32 Gene Targeting Work flow: STEP4 4 Screening della progenie Topo chimera
33 Gene Targeting
34 Gene Targeting Applicazioni Mutagenesi MIRATA può avere come risultato: KNOCK-OUT: INATTIVAZIONE dell espressione di un gene KNOCK-IN: INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (modelli di patologie con mutazioni puntiformi; geni reporter)
35 Gene Targeting Nobel Prize 2007 Mario R. Capecchi Martin J. Evans Oliver Smithies PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007 Motivazione: for their work on "principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells and gene targeting.
36 Gene Targeting Vantaggi e svantaggi RICOMBINAZIONE OMOLOGA L inserzione del transgene è mirata Si conosce la localizzazione genica dell inserimento del transgene; Problemi: espressione tempo e spazio specifica?
37 Limite KO costitutivi: possibile mortalità degli omozigoti durante lo sviluppo. KO condizionali: l induzione della mutazione tempo e tessuto specifica
38 Transgenesi condizionale Il sistema Cre-loxP Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout CARATTERISTICA: inserzione mirata e specifica
39 KO condizionali Il sistema Cre-loxP Sistema di RICOMBINAZIONE del fago P1 CRE (cyclization recombination), ricombinasi specifica LoxP (locus of X-over P1), locus di crossover (2 seq palindrome di 13bp + regione centrale di 8nt) Cre
40 KO condizionali Il sistema Cre-loxP
41 Il sistema Cre-loxP Ricombinazione omologa tra sequenze loxp
42 Il sistema Cre-loxP Esempio di delezione tessuto specifica Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
43 Il sistema Cre-loxP Screening tramite PCR
44 Il sistema Cre-loxP Il topo LERKO: esempio di delezione tessuto specifica Della Torre et al, Cell Metabolism 2011
45 Il sistema Cre-loxP Ricombinazione omologa tra sequenze loxp Controllo dell espressione genica: nello SPAZIO: utilizzo di un PROMOTORE TESSUTO SPECIFICO nel TEMPO: utilizzo di un PROMOTORE dipendente dallo STADIO di SVILUPPO INDUCIBILE
46 Il sistema Cre-loxP Espressione genica programmabile DELEZIONE KO programmabile INSERZIONE K-IN programmabile
47 Il sistema CreER-loxP Delezione spazio/tempo specifica TEMPO SPAZIO CreER(T): proteine di fusione tra Cre e ER (recettore degli estrogeni)
48 The perfect conditional transgenic mouse should include the following criteria: 1. induced overexpression of the transgene should be tightly controlled such that no leaky background expression precludes the accurate analysis. 2. the inducing compound should be nontoxic and highly specific for the target gene. 3. induction kinetics should be fast and expression levels sufficiently high to produce a rapid and detectable effect. 4. the induced switch should be reversible so that defined developmental periods or critical stages in disease can be appropriately monitored. Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
49 Transgenesi condizionale Controllo binario dell espressione genica 3 principal events: 1) ligand-mediated activation of a transcriptional transactivator 2) DNA binding of the transactivator 3) transactivator-induced transcriptional activation Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
50 Transgenesi condizionale Controllo binario dell espressione genica CBS: cognate binding site Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
51 Transgenesi condizionale Controllo binario dell espressione genica Effector mouse, expressing a ligandinducible transcriptional transactivator Responder mouse, which has the capacity to specifically express a chosen transgene upon stimulation by the transactivator. Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
52 Il sistema TET-ON/TET-OFF Sistema a 3 elementi: TeT-Repressor: repressore della trascrizione Tc/Dox: tetraciclina/doxyciclina TRE: tetracycline response element
53 Il sistema TET-OFF TetR: tet repressor VP16: transactivation domain of herpes simplex virus tta Tetraycline controlled transactivator
54 Il sistema TET-OFF. tta: tetraycline controlled transactivator Tet-off system (tta) will activate expression in the absence of its ligand doxycycline. Upon addition of DOX, transcription of the gene of interest is extinguished. Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
55 Il sistema TET-OFF MHC-tTA/tetO-Ro1 mice were obtained by crossing a transgenic mouse line that expresses Ro1 receptor under the control of a teto gene and another mouse line expressing tta gene under the regulation of a heart-specific MHC promoter.
56 Il sistema TET-OFF VANTAGGI Ben note proprietà della Tc/DOX: farmacocinetica, buona distribuzione tissutale, bassa tossicità, capacità di attraversare membrane cellulari Grande induzione in alcuni tessuti (anche 5 ordini di grandezza) SVANTAGGI Attività residua del promoter minimale teto-cmv Tossicità cellulare del transattivatore Bassa sensitività alla DOX in alcuni tessuti Basse cinetiche di induzione in vivo
57 Il sistema TET-ON rtetr: reverse tet repressor VP16: transactivation domain of herpes simplex virus rtta Reverse tet-on Tetraycline controlled transactivator
58 Il sistema TET-ON. rtta: reverse tet-on tetraycline controlled transactivator Addition of DOX to the Tet-on system (rtta) results in transcriptional induction of the gene of interest. Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002
59 . Il sistema TET-ON vs TET-OFF VANTAGGI Aumentata velocità di espressione del transgene: completa attivazione in 1 ora, rispetto alle basse cinetiche di attivazione del sistema tet-off (fino ad una settimana)
60 Il sistema TET-ON/TET-OFF
61 Il sistema TET-ON/TET-OFF La Tc SPEGNE il GENE La Tc ACCENDE il GENE
62 Il sistema TET-ON/TET-OFF
63 Clonazione Trasferimento del nucleo di una cellula somatica in un oocita anucleato SCOPO: ottenimento di gemelli di un fenotipo di interesse CARATTERISTICA: il materiale genetico viene copiato in toto
64 Clonazione I Cloni vengono ottenuti attraverso Somatic Cell Nuclear Transfer
65 Clonazione
66 Clonazione
67 Clonazione Possibili applicazioni: Trapianto con cellule autologhe
68 Clonazione Possibili applicazioni: trapianto con cellule autologhe Cellule staminali ADULTE SCNT
69 Clonazione Efficienza molto bassa & etica
70 Altre tecniche Vettori retrovirali Yac-transgenic mice
71 Vettori retrovirali Integrazione di materiale genetico nella cellula ospite SCOPO: Guadagno di funzione CARATTERISTICA: - inserzione random, casuale - vettore max 8Kb - l animale puo risultare contaminato da retrovirus delle cellule helper
72 Vettore virale Vantaggi Svantaggi Retrovirus Lentivirus Adenovirus Capacità d'inserimento del gene, integrazione stabile nel DNA dell'ospite, elevati titoli di virus ricombinante, ampio tropismo d'infettività, relativa facilità di manipolazione del genoma virale Infezione delle cellule in divisione o meno, espressione stabile del gene, elevata capacità d'inserimento Elevati titoli di virus, alta espressione genica, grande capacità d'inserimento, infezione di cellule in divisione e non in divisione Difficoltà nel controllare l'infezione virale, mancata infezione delle cellule non in divisione, integrazione a caso nel genoma dell'ospite Mutagenesi potenziale presenza di sequenze proteiche regolatrici e accessorie Risposte immuni alle proteine virali, nessuna integrazione nel genoma dell'ospite, espressione genica transitoria Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, bassa immunogenicità e non patogenicità Limitate capacità per i transgeni, difficile generazione di alti titoli virali, presenza di adenoviruds o herpevirus per la moltiplicazione dei virus adeno-associati Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta capacità d'inserzione, tropismo naturale per le cellule neuronali, seguita dalla produzione di alti titoli virali Possibile tossicità, rischio di ricombinazione, nessuna integrazione virale nel DNA dell'ospite Poxvirus Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi framenti di DNA, alti livelli di di espressione transgenica,, seguita da virus vivo ricombinante Virus di Epstein-Barr Infetta cellule in divisione o meno con prevalenza per i linfociti B, alta capacità d'inserimento Possibile effetto citopatico Difficoltà di controllare le linee cellulari
73 Vettori retrovirali
74 Vettori retrovirali Vantaggi e Svantaggi Alta efficienza di trasduzione Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell ospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate (max 8 kb) Reazioni immunitarie Costi elevati
75 Yac-transgenic mice YAC (Yeast Artificial Chromosome) SCOPO: trasferire GENI di grandi dimensioni Kb. CARATTERISTICA: cromosoma artificiale che contiene sequenze (telomeri, centromeri, origini di replicazione) necessarie per la replicazione e la preservazione nelle cellule del lievito.
76 Yac-transgenic mice COME SI TRASFERISCE uno YAC nel TOPO? Fusione di SFEROPLASTI (cellule Lievito senza parete) + cellule ES (rischio di contaminazione con genoma Lievito) Purificazione di YAC (separato per elettroforesi) + microiniezione nel pronucleo (se YAC non ha dimensioni grandi, altrimenti si frammenta) Trasferimento di YAC nelle ES tramite LIPOSOMI (vescicole lipidiche artificiali per fusione con membrana)
77 Yac-transgenic mice
78 Yac-transgenic mice Esempi di applicazione YAC di 670Kb contenente il gene umano HPRT in cellule ES di topo (funzione renale) YAC di 400Kb contenente il gene umano APP in cellule ES di topo (codifica il precursore della proteina amiloide Alzheimer) YAC contenente il gene umano catena leggera/pesante IgG in topo (produzione di anticorpi)
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