struttura quaternaria. supersecondaria Domini

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1 La struttura quaternaria

2 La struttura quaternaria L ultimo livello nella gerarchia strutturale delle proteine è rappresentato dalla struttura quaternaria. Struttura supersecondaria Domini

3 La struttura quaternaria Le proteine che sono costituite da una sola catena polipeptidica sono chiamate monomeriche. Esiste un consistente numero di proteine costituite da un certo numero di catene polipeptidiche idi identiche, i chiamate subunità, che si associano in modo specifico a formare una molecola multimerica. Si dice che queste proteine hanno una struttura quaternaria. Le zone di contatto fra le subunità sono costituite da catene laterali non polari e caratterizzate da interazioni di van der Waals, legami idrogeno e talvolta ponti disolfuro intercatena. Le subunità possono funzionare in modo indipendente una dall altra oppure in modo cooperativo, così che la funzione di una subunità sia dipendente dallo stato funzionale delle altre subunità. Altre proteine sono costituite da catene polipeptidiche e quindi da subunità Altre proteine sono costituite da catene polipeptidiche, e quindi da subunità, diverse, ciascuna con una diversa funzione.

4 La struttura quaternaria Sono svariate le ragioni per cui le proteine costituite da diverse subunità (invece che da un unica enorme catena polipeptidica) sono così comuni. In particolare: - eventuali difetti possono essere riparati sostituendo la subunità difettosa. - Il sito di formazione della subunità può essere diverso da quello di assemblaggio della struttura finale e la sola informazione genetica necessaria è specificare le diverse subunità che si devono assemblare.

5 La struttura quaternaria -nel caso degli enzimi,aumentarnele i dimensioni attraverso l associazione di subunità identiche è più efficiente che aumentare la lunghezza della catena polipeptidica, poiché ogni subunità ha un sito attivo. Inoltre, la costituzione a subunità fornisce le basi strutturali per la regolazione della loro attività.

6 La struttura quaternaria Nel formare i multimeri, le subunità si dispongono in modo simmetrico, cioè occupano posizioni geometricamente equivalenti, secondo le seguenti operazioni di simmetria rotazionale: - simmetria ciclica, in cui le subunità sono correlate da un singolo asse di rotazione; - simmetria diedra, caratterizzata dalla composizione di un asse di rotazione di ordine n con un asse di rotazione di ordine 2 (che si intersecano perpendicolarmente); - altre simmetrie possibili sono quella tetraedrica, ottaedrica e icosaedrica. Kin exercises/protour1-8

7 La struttura quaternaria Alcune proteine multimeriche presentano simmetria elicoidale. Le subunità chimicamente identiche dell elica non sono strettamente equivalenti, perché, per esempio, quelle alle estremità dell elica hanno un environment diverso rispetto a quelle nel mezzo. Tuttavia l intorno di tutte le subunità nell elica, tranne quelle vicino alle estremità, sono sufficientemente simili, per cui le subunità sono dette quasiequivalenti.

8 Ivirus

9 Ivirus I virus sono parassiti costituiti da molecole di acido nucleico (DNA o RNA, a doppia o singola elica) circondate da un rivestimento protettivo costituito da proteine, chiamato capside. Alcuni virus hanno anche una membrana a doppio strato lipidico, chiamato pericapside p oenvelope, che riveste il capside. Un acido nucleico non potrebbe mai codificare una singola molecola proteica tanto grande da racchiuderlo. Il capside dei virus, quindi, è costituito da innumerevoli copie di una o alcune catene polipeptidiche. I virus hanno forme e dimensioni diverse: in particolare, il capside può essere sferico o a bastoncello.

10 Ivirus La conoscenza in dettaglio (struttura tridimensionale a livello atomico) del capside dei virus potrebbe essere importante per progettare farmaci antivirali. Per esempio, l entrata dei virus nelle cellule dei mammiferi dipende dal riconoscimento i specifico, da parte dl del capside virale, di proteine o carboidrati bid i (recettori) che si trovano sulla superficie delle cellule dei mammiferi. Questa interazione gioca un ruolo cruciale e composti che interferiscono con questa interazione dovrebbero bloccare l infezione. I siti di legame virale sulla superficie delle cellule ospite sono anche i target degli anticorpi, per cui il sistema immunitario dell ospite ha con tutta probabilità giocato un ruolo importante nell evoluzione dei virus animali. La conoscenza, quindi, delle regioni di superficie di questi virus dovrebbe aiutare a capire meglio gli adattamenti strutturali che i virus hanno evoluto per eludere le difese dell ospite.

11 Ivirus L esistenza Lesistenza di tutti i virus dipende dalla loro abilità di infettare le cellule, inducendole a generare altre particelle di virus. Le cellule infette generalmente muoiono durante questo processo. Il ciclo di infezione dei virus si può così schematizzare: - i virus rilasciano il loro acido nucleico (ss/ds-dna, ss/ds-rna) nella cellula ospite, spesso insieme a proteine virali;

12 Ivirus - la macchina biosintetica della cellula ospite viene utilizzata per la replicazione, trascrizione e traduzione dei geni virali, a spese dell espressione dei geni cellulari; - le nuove particelle di virus generate lasciano la cellula infettata per infettare nuove cellule.

13 Ivirus Immagini al Immagini al microscopio elettronico

14 Ivirus Le proteine che costituiscono il capside dei virus si dispongono in modo simmetrico o quasi-simmetrico. Sono note due possibili disposizioni (assemblaggi di natura quaternaria, quindi): -virus con capside elicoidale, in cui le subunità proteiche si associano a formare un bastoncello elicoidale; - virus con capside sferico, in cui le subunità proteiche si aggregano a formare un poliedro. Considerato l elevato numero di subunità proteiche (fino ad alcune centinaia) coinvolte nella formazione del capside dei virus, essi rappresentano l esempio più complesso di organizzazione delle proteine in struttura quaternaria.

15 Virus con capside elicoidale Un esempio di virus con capside elicoidale è dato dal virus del mosaico del tabacco (TMV). TMV ha una forma a bastoncello, è lungo circa 3000 Å, ha un diametro di 180 Å e ha una massa di 40 milioni i di dl dalton. Il suo capside è costituito da circa 2130 copie identiche di una proteina (158 aminoacidi), disposte a formare un elica destrorsa cava (diametro cavità circa 40 Å), caratterizzata da n = 16.3 subunità per giro, p =23Å. TMV contiene una molecola di RNA a singola elica che si avvolge nella cavità interna seguendo i giri dell elica elica di proteine, in modo tale che 3 nucleotidi interagiscano con una subunità proteica.

16 Virus con capside elicoidale Lo stato di aggregazione delle proteine del capside di TMV dipende dal ph e dalla forza ionica. - ph basico, bassa forza ionica: le proteine formano complessi di solo alcune subunità; - ph basico, alta forza ionica: le subunità si associano a formare dischi a doppio strato (17 subunità per disco);

17 Virus con capside elicoidale - ph neutro, bassa forza ionica: i le subunità formano corte eliche di poco più di 2 giri, chiamate protoeliche; - ph acido, bassa forza ionica: le protoeliche si impilano in modo imperfetto e alla fine si fondono a formare un lungo bastoncello elicoidale.

18 Virus con capside elicoidale Immagini al microscopio elettronico per seguire l andamento dell aggregazione dll delle proteine del dlcapside di TMV, passando da ph = 7 a ph = 5, in condizioni di bassa forza ionica.

19 Virus con capside elicoidale L analisi cristallografica a raggi X ha mostrato che ciascuna subunità del capside del virus MTV è costituita da un bundle di 4 eliche, dispostoinmodo radiale rispetto all asse dell elica del virus. asse elica virus

20 Structure of the TMV protein disk in cross section showing its polypeptide chains as ribbon diagrams.

21 Assembly of TMV. (a) The process begins by the insertion of the hairpin loop formed by the initiation sequence of the viral RNA into the protohelix s central cavity.

22 Assembly of TMV. (b) The RNA then intercalates between the layers of the protohelix, thereby ordering the disordered loop and trapping the RNA.

23 Assembly of TMV. (c) Elongation proceeds by the stepwise addition of protohelices to the top of the viral rod. Page 1378

24 Electron micrograph of partially reconstituted TMV particles showing that their two RNA tails emerge from the same end of the growing viral rod.

25 Virus con capside sferico Un altro modo in cui subunità equivalenti si dispongono a costituire il capside dei virus è quello di formare un poliedro sferico, secondo due principi base: - specificità: le subunità devono riconoscersi con precisione per formare la giusta interfaccia i di interazionii i non-covalenti, visto che i virus si assemblano spontaneamente dai loro componenti individuali; - economia genetica: il capside è costituito da molte copie di alcuni tipi di subunità. Questi due principi implicano la simmetria: pattern di legame ripetuti e Q p p p p g p specifici di unità costituenti identiche portano ad una struttura finale simmetrica.

26 Virus con capside sferico Come disporre in modo simmetrico oggetti identici in modo tale da costruire una sfera? Esiste solo un numero limitato di modi per farlo e fra questi la simmetria icosaedrica è la più alta possibile, permettendo al maggior numero di oggetti identici di formare una sfera. Lo studio del capside dei virus sferici con il microscopio elettronico e con la cristallografia a raggi X ha indicato che la simmetria icosaedrica sta alla base della loro architettura.

27 Virus con capside sferico L icosaedro è un oggetto approssimativamente sferico costituito da 20 triangoli equilateri identici. La sua simmetria è descritta da tipi diversi di rotazioni, che lo portano a coincidere con se stesso. 12 vertici (asse di rotazione di ordine 5) 20 facce (asse di rotazione di ordine 3) 30 spigoli (asse di rotazione di ordine 2) Kin exercises/viral-coat

28 Virus con capside sferico L icosaedro presenta 12 5 = 60 (o 20 3, o 30 2) posizioni equivalenti. Ogni oggetto che presenta simmetria è costituito da parti più piccole, identiche e messe in relazione una con l altra da operazioni di simmetria; tali parti vengono chiamate unità connesse da simmetria o unità asimmetriche. Le subunità proteiche che costituiscono il capside dei virus sferici sono unità asimmetriche: il numero minimo di subunità proteiche necessarie a formare il capside con simmetria icosaedrica è quindi uguale alle posizioni equivalenti dell icosaedro. Le proprietà di simmetria dell icosaedro non si limitano alla superficie ma si Le proprietà di simmetria dell icosaedro non si limitano alla superficie, ma si estendono all intero volume. Un unità asimmetrica è quindi una parte di questo volume: è un cuneo che parte dalla superficie, fino al centro dell icosaedro.

29 Virus con capside sferico L icosaedro ha 60 unità asimmetriche, per cui il numero minimo di subunità proteiche richiesto per formare il capside di un virus a simmetria icosaedrica è 60. Ciascuna unità asimmetrica può contenere una o più catene polipeptidiche.

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31 X-Ray structure of satellite tobacco mosaic virus (STMV). The virion is shown in cutaway view along its icosahedral (T-1) 5-fold axis. From: Biochemistry Voet & Voet (2004) J. Wiley and Sons Inc.

32 Virus con capside sferico In un capside sferico costituito solo da 60 subunità proteiche ben poco spazio è lasciato alla molecola di DNA/RNA. I virus autosufficienti hanno genomi molto lunghi, che codificano per enzimi necessari alla replicazione del loro acido nucleico virale, oltre che per le proteine strutturali del capside. Questi genomi necessitano ampi spazi all interno del capside e quindi un capside più grande. Come si può costruire un capside più grande mantenendo la simmetria icosaedrica? L aumento delle dimensioni di ciascuna subunità porterebbe ad un piccolo guadagno nelle dimensioni del capside ma ad un notevole suo ispessimento. Il solo modo possibile è aumentare il numero delle subunità, cioè ciascuna unità asimmetrica dell icosaedro deve contenere più di una subunità (che possono essere identiche o diverse).

33 Virus con capside sferico Il numero totale di subunità costituenti il capside deve essere un multiplo intero di 60. Donald Caspar e Aaron Klug nel 1962 hanno dimostrato che solo alcuni multipli interi (1, 3, 4, 7, ) di 60 (subunita proteiche) sono possibili per mantenere la specificità delle interazioni all interno della simmetria icosaedrica, in modo tale che i contatti proteina-proteina siano simili. Questi multipli interi sono chiamati numeri di triangolazione T. I valori di T permessi sono dati dalla seguente formula: T = h 2 + hk + k 2 [h, k interi positivi] NelcasodiT=1le subunità proteiche si impaccano a formare l icosaedro in modostrettamente tt t equivalente. Nel caso di T > 1 le subunità si possono impaccare con pattern di legame solo leggermente diversi, in modo quasi equivalente.

34 Virus con capside sferico:t=1 I virus satellite, che sono non autosufficienti, poiché non codificano da soli tutte le funzioni richieste per la loro replicazione, hanno il capside sferico costituito soltanto da 60 catene proteiche (numeroditriangolazione T=1). ) Un esempio è il virus satellite della necrosi del tabacco, che è anche uno dei più piccoli finora conosciuti. Esso ha un diametro di 180 Å e per replicarsi ha bisogno dell aiuto del virus della necrosi del tabacco. Il suo RNA codifica per una sola catena polipeptidica (195 aminoacidi) idi) per unità asimmetrica dell icosaedro icosaedro.

35 Virus con capside sferico:t=3 Nel caso di T = 3 (180 subunità), ciascuna unità asimmetrica contiene 3 subunità proteiche (A, B e C) con un diverso environment. Le subunità A interagiscono intorno all asse di rotazione di ordine 5, mentre le subunità B e C si alternano intorno all asse di rotazione di ordine 3. Ci sono, quindi, 6 subunità (3 B e 3 C) disposte in modo pseudo-simmetrico intorno all asse di rotazione di ordine 3, che diventa quindi anche un asse di pseudo-simmetria di ordine 6. La disposizione delle subunità intorno all asse di simmetria di ordine 5 e a quello di pseudo-simmetria di ordine 6 dovrebbe essere molto simile, con piccole alterazioni delle modalità di impaccamento. T = 3

36 T = 3 icosadeltahedron. (a) Exact rotational symmetry of an icosahedron (solid symbols) plus local 6-fold, 3-fold, and 2-fold rotational axes (hollow symbols). (b) 3 quasi-equivalent sets of 60 icosahedrally related lobes. From: Biochemistry Voet & Voet (2004) J. Wiley and Sons Inc.

37 Virus con capside sferico:t=3 Un esempio di capside di virus sferico con T = 3 è dato dal virus del pomodoro (tomato bushy stunt virus). Questo virus contiene 180 catene polipeptidiche chimicamente identiche (386 aminoacidi) per un diametro totale di 330 Å. Ciascuna subunità è costituita da un dominio R, una regione di loop (a) che connette R con il dominio S, a formare il guscio virale, edaundominio P che si A proietta fuori dalla superficie. B I domini P ed S sono collegati C da una cerniera (h). Le catene polipeptidiche identiche hanno diverse strutture tridimensionali quando formano le 3 subunità A, B e C.

38 Radial organization of TBSV indicating the distribution of its protein and RNA components. From: Biochemistry Voet & Voet (2004) J. Wiley and Sons Inc.

39 X-Ray structure of the tomato bushy stunt virus (TBSV) coat protein subunit. Page 1381 From: Biochemistry Voet & Voet (2004) J. Wiley and Sons Inc.

40 Virus con capside sferico:t=3 In particolare, la cerniera (h) della subunità C è diversa da quelle nelle strutture A e B, per cui i domini S e P sono orientati in modo piuttosto diverso. Fra A e B non ci sono grandi differenze strutturali, ma solo alcune differenze locali, specialmente nelle zone di interazione. Le differenze conformazionali delle 3 subunità servono per mantenere la quasi equivalenza nella maggior parte delle regioni di contatto e accettare i 3 diversi environment. From: Biochemistry Voet & Voet (2004) J. Wiley and Sons Inc.

41 Virus con capside sferico:t=3 I domini S delle subunità A si impaccano intorno all asse di ordine 5, quelli delle subunità B e C si alternano intorno ad un asse di ordine 3. IdominiPdelle subunità C interagiscono a 2 a 2 intorno all asse di rotazione di ordine 2, mentre quelli delle subunità A e B sono messi in relazione da assi di pseudo-simmetria di ordine 2. A B C

42 Architecture of the TBSV capsid. (a) The C subunit arms of TBSV protein pack about the capsid ss exact 3- fold axes (triangle) and associate as β sheets. From: Biochemistry Voet & Voet (2004) J. Wiley and Sons Inc.

43 Architecture of the TBSV capsid. (b) A stereo cutaway drawing showing the capsid s internal scaffolding of C subunit arms. From: Biochemistry Voet & Voet (2004) J. Wiley and Sons Inc.

44 Virus con capside sferico:t=3 Un altro esempio con T = 3 è dato dai picornavirus, una grande famiglia di virus animali con RNA a singola elica. Essi sono stati classificati in 4 gruppi: - cardiovirus i (virus dell encefalomiocardite), l dit - enterovirus (virus della polio e dell epatite A), - rinovirus (virus del raffreddore), - aftovirus. Tutti questi virus hanno una massa molecolare di circa 8.5 milioni di Dalton, di cui il 30% è dovuto alla molecola di RNA. L RNA occupa l interno della sfera e si estende dal centro per un raggio di 110 Å, mentre il capside che circonda l RNA ha uno spessore di circa Å.

45 Virus con capside sferico:t=3 I loop che protrudono dal capside vengono riconosciuti dal sistema immunitario dell ospite e contengono la maggior parte dei siti di legame per gli anticorpi dell ospite. Le cavità superficiali i circondate da queste protuberanze in alcuni casi rappresentano siti specifici per i recettori sulla superficie della cellula ospite. Le proteine che costituiscono il capside dei picornavirus devono quindi avere la capacità di mantenere i siti dei recettori che rendono i virus infettivi, anche accettando mutazioni per sfuggire alle difese del sistema immunitario dell ospite.

46 Virus con capside sferico:t=3 Il capside di tutti i picornavirus è costituito da 60 copie di ciascuna delle 4 catene polipeptidiche chiamate VP1, VP2, VP3 e VP4 (quest ultima completamente all interno del capside). VP1, VP2 e VP3 sono 3 proteine diverse, senza significativa omologia di sequenza tra loro. Esse, comunque, si dispongono a formare il capside in un modo molto simile a quello osservato per i virus con le 3 catene polipeptidiche chimicamente identiche.

47 Virus con capside sferico:t=3 Questo impaccamento è ottenuto non attraverso cambiamenti conformazionali ma avendo 3 catene polipeptidiche chimicamente diverse, con differenze strutturali locali. Le subunità VP1 si dispongono intorno all asse di ordine 5 e rappresentano la cima di una montagna, mentre le subunità VP2 e VP3 si alternano ai piedi di questa montagna e VP4 ne costituisce le fondamenta.

48 Virus con capside sferico:t=3 Le subunità VP2 e VP3 si alternano intorno ad un asse di ordine 3, ma visto che sono catene polipeptidiche diverse non si può parlare in questo caso di simmetria o pseudo-simmetria simmetria. In prima approssimazione, comunque, esse sono messe in relazione da un asse di pseudo-simmetria di ordine 6, visto che le 2 catene polipeptidiche hanno una struttura tridimensionalemolto i l simile. il

49 Virus con capside sferico Il fatto che i virus sferici vegetali e alcuni di quelli animali abbiano lo stesso modo di disporre le subunità proteiche per costruire l icosaedro, fa ipotizzare che essi siano correlati dal punto di vista evoluzionistico e abbiano un ancestore comune. Questa ipotesi è supportata dall analisi del fold delle subunità proteiche costituenti il capside. L analisi cristallografica ai raggi X ha mostrato che tutte le proteine costituenti il capside dei virus sferici assumono la struttura β-antiparallela con topologia jelly roll.

50 Virus con capside sferico In generale si osserva che i loop ad una estremità del barile sono sempre corti, mentre quelli all estremità opposta sono molto lunghi e di dimensioni variabili. Tali strutture proteiche tih si possono schematizzare con un cuneo. Virus satellite della necrosi del tabacco Subunità VP2 virus raffreddore Subunità VP1 virus polio

51 Virus con capside sferico Un eccezione alla regola è rappresentata dal fold delle proteine che costituiscono il capside del batteriofago MS2 (T = 3). I l i h l In questo caso le proteine hanno la struttura di un foglietto β antiparallelo con topologia up and down.

52 Virus con capside sferico Molti farmaci sono efficaci perché si legano a siti recettoriali specifici, bloccando la funzione fisiologica della proteina. Studi di progettazione di farmaci sono stati condotti sul virus del raffreddore. Nel capside del virus del raffreddore, come in tutti i picornavirus, ci sono zone di canyon (profonde 25 Å e larghe da 12 a 30 Å) che circondano le protuberanze, formate dll dalle proteine VP1.

53 Virus con capside sferico I canyon formano il sito di legame per il recettore del virus dell influenza sulla superficie della cellula ospite. In particolare, il composto antivirale si lega a VP1, inserendosi in una cavità idrofobica sotto il pavimento del canyon.

54 Virus con capside sferico:t=4 Nel caso di T = 4 (240 subunità), ciascuna unità asimmetrica contiene 4 subunità proteiche (A, B, C e D) con un diverso environment. Le subunità A interagiscono intorno all asse di rotazione di ordine 5, le subunità D intorno all asse di rotazione di ordine 3, mentre le subunità B e C sono disposte in modo tale che 2 copie di ciascuna interagiscano intorno all asse di ordine 2, oltre a 2 subunità D. T = 4

55 Virus con capside sferico:t=4 In questo caso l asse di simmetria di ordine 2 diventa un asse di pseudo- simmetria di ordine 6. Le subunità A, B e C interagiscono intorno assi di pseudo-simmetria i di ordine 3 raggruppati intorno all asse di simmetria di ordine 5. Gli assi di pseudo-simmetriasimmetria di ordine 3 sono 60. T = 4

56 Virus con capside sferico:t=4 Un esempio di capside con T = 4 è dato dagli alfavirus, un gruppo di virus mosquito-borne che causano encefaliti, febbre, artrite ed eritemi negli animali. Questi virus sono caratterizzati i da 2 involucri i proteici, iiuno esterno costituito i da glicoproteine ed uno più interno, separati da una membrana a doppio strato lipidico. La struttura tridimensionale delle proteine che costituiscono l involucro più interno del capside degli alfavirus ricorda quella della chimotripsina e di altre proteasi a serina, ed è costituita da 2 barili β-antiparalleli con topologia a chiave greca.

57 Structure of the PBCV-1 capsid. A quasiatomic model based on fitting the X-ray structure of Vp54 to the cryo-em based image of the capsid. and Sons Inc. et (2004) J. Wiley a mistry Voet & Voe From: Biochem