Genetica del cancro. By NA. Lezione 19 1

Transcript

1 Genetica del cancro Lezione 19 1

2 Il tumore come network Le cellule mutate iniziano a duplicarsi in modo incontrollato Carcinoma del colon Displasia. Le cellule perdono morfologia Cancro invasivo Le cellule divengono invasive e metastatizzano Processo di vascolarizzazione Iperplasia Le cellule conservano morfologia Cancro in situ Le cellule perdono il contatto con il tessuto Esempio di progressione a tappe da tumore benigno a tumore maligno 2

3 / Modalita di espressione Gli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche? Perche per manifestare il fenotipo e necessario che entrambi gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse) M Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e quello della cellula non dell individuo! Il tumore va considerato come un individuo : all interno dell organismo ci sono cloni ( individui ) che non manifestano il fenotipo perche hanno un allele wild-type. Una cellula di questi cloni per caso muta l allele wild-type : perde la funzione e si manifesta il tumore Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e sensibile alla quantita di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non ne pregiudica la funzione. 3

4 Oncosoppressori gatekeepers Questi oncosoppressori vengono definiti gatekeepers : (guardiani) perche regolano funzioni cellulari fondamentali come l innesco della proliferazione, del differenziamento e dell apoptosi. La conoscenza del loro meccanismo di azione ha introdotto il concetto di APLOINSUFFICENZA. M APLOINSUFFICENZA: condizione in cui la mancata funzionalita di un allele non provoca la comparsa del fenotipo, ma mette la cellula in condizioni di debolezza. La cellula e eterozigote e il gene puo ancora svolgere la funzione, ma e una funzione non completamente efficace 4

5 L La perdita del prodotto del gene NF1, mutato nella neurofibromatosi di tipo 1, conduce ad una incontrollata attivita di ras. L Oncosoppressori gatekeepers esempi APC, coinvolto nella FAP, regola la trasmissione di un segnale dalla superficie cellulare al nucleo, che porta all espressione di c-myc L La perdita di p53 genera la sindrome di Li-Fraumeni, sottraendo le cellule al processo di apoptosi 5

6 Altri oncosoppressori 6

7 Retinoblastoma Servira come modello per chiarire la teoria del doppio colpo che e stata formulata da Knudson per spiegare il diverso comportamento nei due tipi di retinoblastoma ereditario e non. E servira come modello per comprendere come si puo impostare la ricerca dei geni che controllano le funzioni di base della vita cellulare 7

8 * Retinoblastoma e un tumore maligno della retina che si sviluppa nei primi anni di vita * puo essere monolaterale (solo un occhio colpito) o bilaterale (entrambi gli occhi) * si puo manifestare in forme sporadiche o ereditarie diagnosticate a 7-10 anni, generalmente monofocali (solo in un punto dell occhio) diagnosticate nel primo anno di vita, multifocali (piu punti di un occhio) 8

9 Genetica del retinoblastoma retinoblastoma bilaterale retinoblastoma monolaterale non-penetrante Apparente trasmissione dominante... 9

10 Alfred Knudson Nel 1971 Alfred Knudson analizzo casi di bambini con retinoblastoma sia monolaterale che bilaterale * Osservo che: al momento della diagnosi, i bambini che avrebbero sviluppato tumori bilaterali erano piu piccoli di quelli per i quali i tumori sarebbero rimasti monolaterali; * con l aumentare dell eta, la frequenza con cui venivano diagnosticati i casi bilaterali cresceva in maniera esponenziale, mentre quella relativa ai casi monolaterali aumentava molto piu lentamente. 10

11 Modello del doppio colpo Knudson propose un modello ( two-hit hypothesis ) secondo il quale, affinche si abbia il retinoblastoma, e necessario che in una linea di cellule retiniche si verifichino due distinti eventi mutazionali I evento ( hit ) II evento ( hit ) * I soggetti con retinoblastoma ereditario hanno ereditato una di queste mutazioni, la quale, pertanto, e presente in tutte le loro cellule retiniche e, quindi, e necessario un secondo evento perche si produca il tumore. * Il retinoblastoma sporadico, invece, si forma solo quando due eventi mutazionali indipendenti avvengono nella stessa linea cellulare. Cio si realizza piu raramente, per cui l insorgenza e piu tardiva e i tumori sono invariabilmente monolaterali. 11

12 Il gene del retinoblastoma (Rb) Il primo indizio sulla posizione del gene Rb e stato fornito da soggetti rari affetti da retinoblastomi bilaterali, concomitanti anomalie congenite e assenza di familiarita delezion e 13q13- q14 L analisi cromosomica di questi pazienti ha dimostrato la presenza di una delezione del braccio lungo del cromosoma 13 di dimensione variabile ma con condivisione delle bande 13q13-q14: questa osservazione suggeriva che in tale regione si localizzasse un gene predisponente al retinoblastoma 12

13 / Rb ed esterasi Questi bambini presentavano anche una delezione di una copia del gene per l enzima esterasi D, enzima di funzione sconosciuta ma facilmente dosabile. Presenta un polimorfismo con due alleli, evidenziabile mediante elettroforesi di proteine. / I bambini con una delezione a carico di 13q14 producevano meta della quantita normale di esterasi D ed esprimevano invariabilmente un solo allele. IL esterasi con il suo polimorfismo era lo strumento ideale per studiare il gene del retinoblastoma 13

14 Linkage di esterasi e Rb L analisi di linkage esaminando la segregazione del polimorfismo dell esterasi D in famiglie con retinoblastoma ereditario e prive di delezione: gli alleli dell esterasi D segregavano nelle famiglie insieme al carattere retinoblastoma (lod score>3), fornendo indicazione che il gene predisponente alla malattia fosse localizzato a livello della banda 13q14. 14

15 * * Verifica dell ipotesi di Knudson Una mutazione in un gene del cromosoma 13 che costituirebbe al primo evento secondo l ipotesi di Knudson e presente nelle cellule normali dei portatori Il secondo evento sarebbe consistito nella perdita della copia normale rimanente di questo gene... Per testare questa ipotesi si e usata nuovamente l esterasi D, espressa nelle cellule del retinoblastoma, per vedere quali suoi alleli fossero espressi I I tumori analizzati erano stati ottenuti da soggetti eterozigoti per il polimorfismo dell esterasi D e non portatori di delezione costituzionale del cromosoma

16 J Verifica dell ipotesi di Knudson Atteso: entrambi gli alleli avrebbero dovuto essere espressi L Osservato: solo un allele viene espresso in 2/3 dei tumori analizzati M? il secondo evento consisteva probabilmente in una delezione che includeva i loci sia dell esterasi D che del retinoblastoma Per la verifica del secondo evento, si puo ricorrere a tecniche di biologia molecolare, come il Southern Blot di DNA dei soggetti di una famiglia affetta usando sonde del cromosoma 13 per testare la perdita di eterozigosita (LOH) 16

17 * La LOH si puo applicare sia ai tumori familiari che a quelli sporadici, suggerendo che, in entrambi i casi, gli eventi che conducono allo sviluppo del tumore interessino un locus sul cromosoma 13. I LOH C e una cosa da tenere presente: le cellule tumorali hanno lo stesso background genetico delle normali perche appartengono allo stesso individuo: le differenze fra loro sono imputabili al processo tumorale, non alla variabilita genetica e questo permette di utilizzare anche gli sporadici * Nei casi familiari, gli alleli mantenuti nel tumore erano invariabilmente quelli ereditati dal genitore affetto 17

18 * Clonaggio del gene del retinoblastoma la ricerca del gene si è concentrata sulla banda 13q14 e si sono cercate le sequenze espresse nelle cellule retiniche normali, che risultassero mutate nei soggetti affetti da retinoblastoma familiare * il punto di partenza è stato fornito dalla scoperta di un gruppo di tumori che presentavano una delezione omozigote corrispondente ad una sequenza di DNA clonata dalla regione 13q14 18

19 * * Clonaggio del gene del retinoblastoma Nel retinoblastoma il trascritto era assente o di dimensioni molto diversi dal normale pazienti con retinoblastoma ereditario portatori di tumori con delezioni omozigoti presentavano delezioni eterozigoti nei tessuti costituzionali... Ipotesi di Knudson confermata! Rb e un oncosoppressore 19

20 M Ricerca delle mutazioni In molti casi le mutazioni non consistono in delezioni o alterazioni a carico del gene tali da poter essere individuate con Southern blot, ma in mutazioni puntiformi piu difficili da evidenziare I test molecolare: sequenziamento esonico dopo PCR per rivelarle 20

21 Meccanismi di acquisizione della seconda mutazione + + Rb -- Non disgiunzione e duplicazione C.O mitotico + Rb delezione mutazione puntiforme + Rb Conversione genica Rb Rb Rb Rb Rb x Rb + Rb + Rb 21

22 Perdita di eterozigosita LOH famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell esterasi D Cellule tumorali omozigote eterozigote eterozigote LOH 22

23 Perdita di eterozigosi per identifiare un TS 23

24 Perdita di eterozigosi / instabilita 24

25 come funzionano i TS 25

26 controllo dell integrita del genoma 26

27 Il materiale didattico e presente in rete: NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul libro 27