per la valutazione dell assetto emoglobinico Laboratorio Centralizzato Policlinico Universitario Ospedaliero S.Orsola Malpighi Bologna Rita Mancini

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Stefania Romani
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1 1 anno esperienza UKNEQAS per la valutazione dell assetto emoglobinico Laboratorio Centralizzato Policlinico Universitario Ospedaliero S.Orsola Malpighi Bologna Rita Mancini

2 Policlinico Ospedaliero Universitario: 158 Degenze 98 Ambulatori Divisionali 57 D.H. e D.S. 11 ambulatori prelievi nel territorio afferenti al laboratorio Bacino di utenza area provincia Bologna; abitanti 22 ambulatori prelievi distribuiti sul territorio

3 Laboratorio centralizzato Patologia Clinica test eseguiti 2011: assetti emoglobinici richiesti 2011: 3 858

4 Perchè scegliere UKNEQAS? VEQ fornita da ditta diversa da quella utiizzata per routine (criterio indicato per accreditamento) Esercizi con cadenza trimestrale a valutazione rapida Tabelle di valutazione chiare Valutazione globale della prestazione Valorizzazione dell aspetto formativo Rispecchia percorso diagnostico

5 I percorsi diagnostici si concretizzano al meglio attraverso l utilizzo di Linee guida

8 Anamnesi Corretto invio e conservazione del campione Emocromo Ferro, ferritina, % saturazione transferrina HPLC Elettroforesi Valutazione morfologia eritrocitaria, ricerca inclusi eritrocitari, reticolociti Test di supporto : falcizzazione, P50, test di stabilità, bilirubina Conclusione Commento ai risultati con suggerimento ad una possibile diagnosi o continuazione nel percorso diagnostico

9 Conservazione e trasporto di campioni ematici destinati all analisi dei difetti Hb (provetta con EDTA) 24 h per analisi morfologica 4 C per 1 settimana (t. biochimici) 4 C per 10 gg o alcuni mesi a 30 C (a. molecolare)

10 Informazioni anamnestiche richieste al prelievo Data prelievo: Cognome: Nome: Data Nascita: Provenienza: Quesito diagnostico: (indicare anche se esame già eseguito in precedenza) Eventuali gravidanze (indicare l età gestazionale): Esami partner già eseguiti o in corso: Terapie negli ultimi 3 mesi: Patologie (tiroide, anemia, ): Anamnesi familiare (eventuali emoglobinopatie, anemie note o presunte):

11 HPLC Tecnica cromatografica ad alta pressione (circa 25 atm)che consente la separazione delle frazioni Hb. Fase stazionaria : resina a scambio anionico, contenuta in una cartuccia analitica; Fase mobile: tampone TRIS Fosfato a differente concentrazione. Rilevazione frazioni eluite: Spettrofotometro UV/VIS a doppia L:O: 415 nm per assorbanza di ogni frazione, 690 nm asorbanza del fondo

12 Metodo elettroforetico Sfrutta la diversa mobilità degli ioni in campo elettrico. Le frazioni Hb caricate elettricamente in funzione del Ph Elettroforesi su fase liquida (EF capillare) Elettroforesi su fase solida (carta e acetato di cellulosa) Elettroforesi su gel(agar, agarosio e poliacrilammide) Il supporto deve essere scelto in funzione delle frazioni da separare

16 Criticità diagnostiche Interpretare valori di HbA2 border line Esperienza nell identificare la possibile presenza di variante Non tutto ècome appare. Refertazione con commenti standardizzati Refertazione sangue neonatale

17 Rbc: 5.63 Hb: 14.3 MCV:81.3 MCH: 26.5 RBC:5.88 Hb: 12 MCV:67.6 MCH:20.4

19 Anamnesi: padre e tre figli lievemente microcitemici a bilancio marziale normale. Origine paterna: Grecia e Sicilia. Padre e figli hanno lo stesso comportamento in HPLC RBC: /mmc Hb: 12.1 g/dl MCV: 76.6 fl MCH: 25.0 pg MCHC: 32.6 g/dl Bilirubina lievemente aumentata. Conclusione: si invia a centro di secondo livello per analisi di probabile variante alfa?

20 Risultato analisi secondo livello:

21 Quello che si vede..

22 Quello che è. Analisi molecolare geni beta e alfa

23 Famiglia di origine nigeriana. Bambino 1 aa inviato perché padre portatore di HbS. Madre non studiata precedentemente. Madre Padre

24 Diagnosi emoglobinopatie alla nascita Per donazione sangue cordonale alla banca dei tessuti Per accertare il fenotipo di neonato di coppia con difetti accertati o presunti Per screening di popolazione

25 Percorso diagnostico per sangue neonatale Fase preanalitica: Informazioni anamnestiche sui genitori e familiari Consenso informato Informativa sui limiti del test Fase analitica: HPLC (EF?) Emocromo solo parzialmente informativo Test di conferma o supporto Fase post analitica Referto articolato con assetto emoglobinico (HbA +HbF +x) Valore di HbA2 in tracce non ha significato diagnostico

26 Sangue neonatale Neonato alla 40 settimana anamnesi familiare segnalata dalla ginecologa come negativa provenienza Nigeria RBC: /mmc Hb:11.9 g/dl MCV: 114 fl MCH: 38.2 pg MCHC: 33.4 g/dl

27 Sangue cordonale Neonato alla 40 settimana anamnesi familiare negativa RBC: /mmc Hb: 13.6 g/dl MCV: 82 fl MCH: 26.4 pg MCHC: 32.0 g/dl

28 Referto laboratorio I livello Referto molecolare

29 Il nostro gruppo di lavoro Attività inserita nel settore Sieroproteine 6 tecnici ruotano nelle varie postazioni di lavoro 2 dirigenti Biologi 1 dirigente medico in formazione Percorso analitico: 1 passaggio: HPLC, emocromo (eventuale vetrino) 2 passaggio : bilancio marziale 3 passaggio in caso di variante: EF capillare, test di Falcizzazione se sospetta HbS, morfologia delle emazie,p50 per varianti sospette a alterata affinità per O 2

30 La valutazione della qualità del nostro percorso diagnostico III esercizio 2012 SEX: FEMALE AGE: 27 YEARS CHINESE Rbc: /L Hb: 121 g/l MCV:73.8 FL MCH20.6 PG

31 Valutazione degli operatori N operatore Risultato commento 1 HbS confermata da T.falcizzazione % notevolmente bassa; possibile inquinamento? 4 HbS confermata da T.falcizzazione % ridotta e copresenza indici eritrocitari alterati: possibile tratto alfa tal si consiglia valutazione e analisi partner 1 HbS confermata da T.falcizzazione % notevolmente ridotta; potrebbe esserci tratto alfa ma ci si aspettia % HbH che non c è 1 HbS confermata da T.falcizzazione % troppo ridotta per poter formulare ipotesi di solo copresenza tratto alfa

32 UKNEQAS: Risultati Valutazione III esercizio Variante catena delta Somma di HbA2 e variante correla con indici eritrocitari alterati Conclusione: Tratto beta talassemico in presenza di variante della catena delta Nostra interpretazione: corrisponde a natura del campione inviato in quanto preparato con aggiunta di HbS.

33 Esercizio UK NEQAS su sangue neonatale

35 Valutazione di sangue neonatale in VEQ Come rispondere all esercizio? % rilevate dalla strumentazione (qualità analitica) % refertate secondo linee guida (valutazione dell attività di refertazione) Suggeriamo maggiore rilevanza alla valutazione della refertazione perché l indagine analitica può essere fatta su altro tipo di campione.

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