1 Capitolo 9. Attivazione dei linfociti T

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1 1 Capitolo 9. Attivazione dei linfociti T I linfociti T maturi che non hanno mai incontrato l antigene si concentrano negli organi linfoidi secondari dove hanno la possibilità di riconoscere antigeni presentati dalle MHC di cellule dentritiche mature e quindi di attivarsi. Una volta attivate seguono i processi di espansione e la differenziazione in cellule effettrici o della memoria. Sia i linfociti T naive che le cellule dentritiche mature sono attratti nelle aree T per azione di chemochine che interagiscono con i recettori CCR7. Una volta avvenuto l incontro, il riconoscimento dell antigene presentato dalle MHC e l interazione tra le proteine B7 espresse dalla cellula dendritica e il corecettore CD28 determinano l attivazione dei linfociti T. Una volta attivato il linfocita inizia a secernere IL-2 (interleuchina 2), una citochina autocrina che avvia l espansione clonale. Alcuni linfociti T lasciano gli organi linfoidi ed entrano in circolo, altri rimangono lì per aiutare i linfociti B a differenziarsi in plasmacellule. Le risposte T terminano principalmente per apoptosi dei linfociti T attivati dovuta alla eliminazione dell antigene che li depriva dello stimolo di sopravvivenza. 1.1 Attivazione dei linfociti CD4 L attivazione presuppone che antigene e linfociti naive si trovino nello stesso tessuto linfoide. L antigene raggiunge i linfonodi mediante drenaggio linfatico oppure raggiunge la milza attraverso il circolo ematico. L antigene si sposta trasportato dalle cellule dendritiche e viene presentato in associazione alle molecole MHC di classe II per l attivazione dei CD4. Per l attivazione dei linfociti CD4 sono necessari due segnali: riconoscimento dell antigene associato a MHC e molecole costimolatorie B7-1 e B7-2. Per la proliferazione è necessaria inoltre la autosecrezione di IL-2; affinchè vi sia secrezione di Il-2 e parallela espressione del suo recettore è prima necessario che il linfocita abbia riconosciuto l antigene. In questo modo abbiamo proliferazione delle sole cellule specifiche e necessarie, proliferazione che coinvolge dunque un unico clone cellulare e definita espansione clonale. Con l eliminazione degli antigeni la maggior parte dei T attivati muore riportando il numero di linfociti a condizioni basali. 1.2 Attivazione dei linfociti CD8 Affinchè vi sia attivazione questa volta serve che l antigene sia presentato da molecole MHC di classe I. I linfociti T CD8 hanno il compito di eliminare cellule infettate. Le risposte da questo gruppo di linfociti sono sollecitate da peptidi microbici presenti nel citosol delle cellule infette: questo pone un problema perchè gli antigeni riconosciuti possono essere prodotti anche all interno di una cellula che non è una APC professionale; le cellule dendritiche hanno però la speciale capacità di catturare e ingerire le cellule infette o tumorali e di presentarne gli antigeni ai CD8 naive in un processo detto cross-presentazione. L attivazione dei CD8 è facilitata dall azione dei CD4: nel caso di una forte risposta innata quest ultima è superflua ma diventa indispensabile per risposte a infezioni latenti,tumori ecc. I linfociti T helper producono citochine che stimolano la differenziazione dei CD4, inoltre esprimono la proteina CD40L che viene riconosciuta dal recettore CD40 sulle APC: questo ne aumenta l efficacia nello stimolare la differenziazione dei CD8. Alla pari dei CD4, anche i CD8 vanno incontro ad espansione clonale tuttavia in modo molto più massiccio: si passa da un linfocita specifico ogni 10 6 linfociti a uno ogni dieci. In seguito all espansione si ha la differenziazione in cellule effettrici CTL caratterizzate dalla presenza di granuli citoplasmatici legati alla membrana contenenti proteine citolitiche quali la perforina e granzimi. Inoltre sono in grado di produrre citochine tra cui IFN-γ e TNF. Due fattori di trascrizione sono richiesti per questa nuova espressione genica: T-Bet e Eom. 1.3 Molecole costimolatorie La differenziazione e proliferazione dei linfociti T naive richiedono molecole costimolatorie espresse dalle APC: in assenza di costimolazione, anche in caso di incontro con l antigene, i linfociti T muoiono per apoptosi in quanto incapaci di rispondere. La molecola meglio caratterizzata sui linfociti T è il recettore di membrana CD28 che lega le glicoproteine costimolatorie B7-1 e B7-2 espresse sulle APC; B7-2 è espressa costitutivamente mentre B7-1 solo in cellule attivate. Prodotti microbici che legano il TLR e citochine, soprattutto IFN-γ, aumentano l espressione delle B7, così come l interazione CD40L:CD40. 1

2 Le cellule dendritiche sono quelle che presentano la maggior espressione di queste glicoproteine e quindi rappresentano le cellule più potenti nell attivare i linfociti T naive. Molti adiuvanti hanno come funzione lo stimolare l espressione di molecole costimolatorie sulle APC. L assenza di molecole costimolatorie sulle APC contribuisce alla tolleranza verso gli antigeni self, poichè ogni APC presenta antigeni self ai linfociti T è proprio la mancanza di molecole costimolatorie che assicura che le cellule T non si attivino in associazione alla selezione negativa durante la fase di maturazione. I linfociti T effettori e della memoria sono meno dipendenti dalla costimolazione di B7 e sono quindi in grado di rispondere ad APC in tessuti non linfoidi in cui non sono espresse le B7. Il controllo delle funzioni delle cellule T effettrici è effettuato da linfociti T regolatori deputati a inibire le funzioni effettrici. Il meccanismo di azione pro attivatorio dell interazione CD28:B7 è compreso in modo parziale. I segnali prodotti aumentano la produzione di citochine, specialmente l autocrina IL-2, inoltre si ha l aumentata espressione della proteina anti apoptotica Bcl-x. Oltre alle molecole attivatrici CD28 esistono anche molecole costimolatorie inibitrici sempre appartenenti alla famiglia delle CD28, primo esempio la CTLA-4. Questa lega sempre molecole B7 tuttavia funge da regolatore negativo nella attivazione. Altra molecola inibitoria è PD-1 che lega molecole appartenenti alla famiglia delle B7 chiamate B7-DC e B7-H1 andando a regolare negativamente l attivazione del linfocita. Ultimo recettore costimolatore è chiamato ICOS e lega il ligando di ICOS con particolare rilevanza nell attivare funzioni effettrici quali la produzione di IL-10 e IL-4. L attivazione di CD28 è cruciale per dare inizio alla risposta dei linfociti CD4 mentre quella di ICOS per le cellule T effettrici. Si ipotizza che CTLA-4 inibisca rispote acute negli organi linfoidi mentre PD-1 quelle croniche e quelle in tessuti non linfoidi. 1.4 Trasduzione del segnale La trasduzione del segnale in cellule naive attiva geni normalmente silenti i cui prodotti sono responsabili della risposta e delle funzioni del linfocita attivato. Prima abbiamo visto come citochine e molecole costimolatorie fossero un punto chiave nell espansione clonale e nella differenziazione: l attivazione del TCR è responsabile invece della specificità. Il TCR non possiede attività enzimatica intrinseca e si trova associato al complesso CD3 e alla catena ζ formando il complesso del TCR che possiede, nel versante citoplasmatico, strutture dette domini ITAM: la fosforilazione di questi domini dà inizio alla trasduzione del segnale. Si assiste all attivazione di via di trasduzione parallele che confluiscono nell attivazione di determinati fattori di trascrizione;le vie sono principalmente tre: 2

3 la via della calcineurina che attiva NFAT la via della PKC che attiva NF-κB la via delle MAP chinasi che attivano AP-1 Queste tre vie sono a loro volta attivate mediante specifiche tirosin chinasi che mediano il segnale tra TCR e gli enzimi sopra citati. Tirosin chinasi Una volta formato il complesso del TCR quando il recettore si lega all antigene e MHC una tirosin chinasi chiamata Lck associata a CD4 e CD8 si sposta vicino alle sequenze ITAM del complesso CD3 e della catena ζ attivandosi e fosforilando le tirosine in esse contenute. Queste tirosine fosforlate fungono da ancoraggio per un altra tirosin chinasi chiamata ZAP -70 che una volta legatasi viene anche essa fosforilata da Lck attivandosi e andando a fosforilare numerosi substrati che fungono da proteine adattatrici di altre molecole coinvolte nella trasduzione del segnale. Altro gruppo di chinasi importanti sono le PI-3 chinasi attivate dalla costimolazione di CD28: questi enzimi catalizzano la generazione di fosfatidil inositolo tre fosfato (PIP 3 ) a partire dal PIP 2 di membrana. Le attività delle chinasi citate sono regolate da specifiche tirosine fosfatasi reclutate dal complesso TCR e chiamate SHP-1 e SHP-2 che inibiscono la trasduzione del segnale e un altra è la SHIP. Formazione della sinapsi immunologica La regione di contatto tra il linfocita T e la sua APC prende il nome di sinapsi immunologica. Le molecole che vengono subito spostate verso il centro di questa struttura sono il complesso TCR, i corecettori CD4 o CD8, i recettori per i costimolatori (CD28) e vari enzimi associati. La segnalazione viene avviata all interno di questa struttura sovramolecolare. Reclutamento e attivazione delle proteine adattatrici ZAP-70 si porta a fosforilare parecchie proteine adattatrici in grado di legarsi a molecole segnalatorie. Le proteine adattatrici presentano domini ricurrenti di tipo SH2 o SH3 che consentono loro di formare cluster di enzimi in tempi rapidi. Un evento chiave dell attivazione del linfocita T è la fosforilazione da parte di ZAP-70 della proteina adattatrice LAT, la quale è in grado di legarsi direttamente alla fosfolipasi Cγ1; la fosfolipasi è una molecola fondamentale che recluta altre proteine tra le quali SLP-76 e Grb-2. Via della MAP chinasi La via Ras è iniziata a seguito del legame del TCR e porta all attivazione di ERK, membro fondamentale della famiglia delle MAP kinasi che porta alla mobilitazione di diversi fattori di trascrizione. Ras nella sua forma inattiva è legato ad una molecola di GDP che, quando viene sostituita da una di GTP, è responsabile dell attivazione. L attivazione di Ras coinvolge le proteine LAT e Grb-2, in quanto la catena di eventi è la seguente: 1. Fosforilazione di LAT da parte di ZAP Reclutamento di Grb-2 su LAT 3. Reclutamento del fattore Sos da parte di Grb-2/LAT 4. Scambio di GTP per GDP su Ras grazie alla catalisi di Sos 5. Attivazione delle MAP kinasi Esistono tre MAP kinasi principali nei linfociti T, delle quali il prototipo è ERK. L attivazione di ERK lo porta a traslocare nel nucleo e a fosforilare una proteina detta Elk, la quale stimola la trascrizione di Fos, un componente del fattore di trascrizione AP-1. In parallelo all attivazione lungo la via Ras si ha il reclutamento di una piccola proteina detta Vav, la quale scambia GTP per GDP su una proteina detta Rac. Rac in forma attiva inizia una cascata segnalatoria parallela che termina nell attivazione della MAP kinasi JNK che si porta a fosforilare c-jun, il secondo membro del fattore di trascrizione AP-1. 3

4 Segnali calcio e fosfolipasi dipendenti La fosfolipasi Cγ1 è un enzima citosolico reclutato da LAT fosforilata e fosforilato da ZAP-70 e altre chinasi. La fosfolipasi fosforilata si porta ad idrolizzare il fosfolipide di membrana PIP 2 producendo così IP 3 e DAG. Il ruolo fisiologico di IP 3 è l aumento del calcio citoplasmatico per apertura di canali nel reticolo endoplasmatico; questa fuoriuscita dal reticolo attiva i canali CRAC che facilitano l arrivo di altro calcio dal reparto extracellulare (difetti nel gene che codifica Orai, componente del canale CRAC, sono alla base di alcune rare immunodeficienze umane). Il calcio citoplasmatico agisce da molecola segnalatoria legandosi a varie calmoduline delle quali una fondamentale è la calcineurina. Il DAG attiva invece l enzima PKC che è coinvolto nell attivazione e nella traslocazione nucleare di NF-κB. Attivazione dei fattori di trascrizione I fattori di trascrizione che sono attivati nei linfociti T a seguito del riconoscimento antigenico sembrano critici per quasi tutte le risposte di queste cellule e sono: NFAT Questo fattore è richiesto per l espressione di IL-2, IL-4, e TNF. Questo fattore è presente in forma inattiva serina-fosforilata nei linfociti T a riposo. La sua attivazione è legata alla calcineurina, che defosforila la molecola e ne svela la sequenza di localizzazione nucleare. 4

5 AP-1 Questo fattore in realtà è una famiglia di molecole leganti DNA. La molecola meglio compresa è quella formata dalle subunità c-jun e Fos. AP-1 sembra essere un punto di convergenza di parecchie vie segnalatorie attivate dal riconoscimento antigenico. NF-κB Questo fattore è essenziale per la sintesi di parecchie citochine. Nei linfociti a riposo la molecola è presente in complesso con inibitori specifici (IκB) che ne bloccano l ingresso nel nucleo; i segnali del TCR causano l ubiquitinazione degli inibitori, quindi la loro degradazione e quindi il ripristino della capacità del fattore di entrare nel nucleo. 1.5 Attenuazione della risposta I meccanismi inibitori sono mediati da varie strategie quali il reclutamento delle fosfatasi SHP-1, l attivazione dei recettori inibitori di famiglia CD28 e il reclutamento di proteine dette E3 ubiquitin ligasi che degradano certe molecole. Recettori inibitori Il prototipo del recettore inibitorio è CTLA-4, di cui però si sa poco del meccanismo di azione. Normalmente questa molecola è sequestrata in vescicole intracellulari che vengono rapidamente mobilitate con la formazione della sinapsi immunologica. Nella sinapsi CTLA-4 potrebbe competere con CD28 per legare le molecole B7 o reclutare fosfatasi che bloccano l attivazione dei domini ITAM. L altro recettore inibitorio di interesse è PD-1, indotto in linfociti B, T e monociti a seguito dell attivazione. PD-1 ha due ligandi, PD-L1 e PD-L2, omologhi ai B7 ed espressi su cellule dendritiche attivate, monociti e altre cellule. Il recettore contiene sul lato citoplasmatico dei domini ITIM che contribuiscono al reclutamento delle fosfatasi SHP-1 e SHP-2 che attenuano il segnale. 5