1 Capitolo 6. Processamento dell antigene e presentazione ai linfociti

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1 1 Capitolo 6. Processamento dell antigene e presentazione ai linfociti T Le caratteristiche più importanti del riconoscimento antigenico da parte dei linfociti T sono: Riconoscimento (quasi) esclusivo di strutture peptidiche. I linfociti B sono invece in grado di riconoscere peptidi, proteine, acidi nucleici, polisaccaridi, lipidi e piccole molecole. Riconoscimento di specifiche sequenze peptidiche. I linfociti B riconoscono invece strutture molecolari tridimensionali; i linfociti T sono quindi in grado di discriminare tra antigeni diversi anche per un solo aminoacido. Totale dipendenza dalle APC. I linfociti T riconoscono solamente i peptidi presentati sulle molecole MHC espresse dalle APC. Totale dipendenza dall MHC. Questa proprietà è alla base della cosiddetta restrizione al self MHC. La restrizione all MHC deriva dalla maturazione dei linfociti nel timo; in questa fase i linfociti che esprimono recettori per MHC vengono fatti sopravvivere, quelli che non riconoscono queste molecole vengono invece eliminati. Questo dimostra come le molecole MHC siano parte integrante dei ligandi dei linfociti T. Fondamentale è poi la reattività a molecole MHC non self: questo processo è alla base del rigetto dei trapianti. I linfociti CD4 + riconoscono MHC II, i linfociti CD8 + riconoscono MHC I. La ragione è che CD4 lega direttamente la classe due del MHC, mentre CD8 lega la classe I. I CD4 + legano soprattutto proteine extracellulari internalizzate dalle APC, mentre i CD8 + legano soprattutto proteine endogene. La ragione di questa differenza sta nel pathway seguito dalle APC per presentare questi due tipi di antigeni. Esiste inoltre un sistema di presentazione antigenico accessorio che è specializzato per gli antigeni lipidici. La molecola CD1 (simil MHCI nonpolimorfica) viene espressa su molte APC ed epiteli e ha il compito di presentare i lipidi a una popolazione di cellule T stranamente non MHC-ristretta. 1.1 APC Tutte le funzioni dei linfociti T dipendono dalle loro interazioni con altre cellule. In generale la risposta antigene specifica di queste cellule richiede la partecipazione delle APC che catturano, trasformano e presentano l antigene. Le APC svolgono due importanti lavori nell attivazione delle cellule T: Convertono antigeni proteici in peptidi e li presentano associati come complessi MHC. La conversione prente il nome di processing. Alcune APC forniscono stimoli accessori per i linfociti T: questi costimolanti sono richiesti per una piena risposta dei linfociti, specialmente i CD4 + naive. La funzione di presentazione è stimolata dall esposizione a prodotti microbici. Le cellule dendritiche e i macrofagi esprimono TLR che rispondono ai microbi aumentando l espressione dell MHC e dei costimolanti e attivando le APC che producono citochine. In aggiunta le cellule dendritiche e i macrofagi attivati esprimono recettori per chemochine che ne causano la migrazione ai siti di infezione. Per indurre una risposta dei linfociti T ad un antigene proteico per via sperimentale è necessario somministrare anche sostanze chiamate adiuvanti. Gli adiuvanti possono essere prodotti microbici o sostanze che ne mimano le caratteristiche. Differenti tipologie cellulari agiscono da APC per attivare i linfociti T naive. Le cellule dendritiche sono le più efficaci nell attivare i naive CD4 + e CD8 +. I macrofagi presentano antigeni ai CD4 + già differenziati (effettori) mentre i linfociti B presentano gli antigeni ai linfociti T helper durante le risposte umorali. Cellule dendritiche, macrofagi e linfociti B esprimono sia MHC II che costimolanti e possono dunque attivare i linfociti T CD4 + : sono pertanto definite APC professionali. 1

2 1.1.1 Presentazione ai linfociti T naive Le cellule dendritiche sono presenti in quasi tutti i tessuti e si identificano per le proiezioni membranose. Tutte queste cellule probabilmente nascono da precursori midollari e quasi tutte sono legate alla linea dei fagociti mononucleati. Il prototipo di cellula dendritica epiteliale è la cellula di Langerhans dell epidermide: queste cellule occupano fino al 25% della superficie dell epidermide pur essendo l % del totale. Normalmente queste cellule sono in condizione di riposo; in risposta all incontro di un componente microbico queste cellule maturano mentre migrano ai linfonodi diventando efficaci APC. Le cellule dendritiche mature risiedono nella zona T del linfonodo, dove presentano gli antigeni ai linfociti T. Le risposte dei CD4 + iniziano nei tessuti linfoidi periferici, dove gli antigeni vengono trasportati dopo essere stati catturati. Le APC immature esprimono recettori di membrana che legano i microbi: grazie a questi riescono a catturare e processare l antigene. Le cellule dendritiche attivate perdono la loro aderenza per gli epiteli e iniziano ad esprimere il recettore per chemochine CCR7: questo le farà guidare verso la zona T del linfonodo (era lo stesso recettore che guidava i linfociti T naive verso la regione corretta). Il legame con l antigene converte le cellule dendritiche da cellule la cui funzione è catturare a cellule la cui funzione è presentare gli antigeni: le cellule dendritiche attivate esprimono alti livelli di molecole MHC II. Le cellule dendritiche sono le migliori APC per via di alcune loro caratteristiche: Sono strategicamente posizionate lungo le più comuni vie di ingresso di patogeni. Esprimono recettori utili a legare i microbi. Migrano di preferenza nelle stesse regioni di linfonodo all interno delle quali circolano i linfociti T naive. Esprimono ad alti livelli i costimolanti. Gli antigeni possono arrivare al linfonodo anche in soluzione nel plasma: una volta a destinazione verranno processati dai macrofagi e dalle cellule dendritiche residenti. Il processo di accumulo degli antigeni è potenziato da due accorgimenti anatomici. Il primo è rappresentato dalle collezioni di tessuto linfoide secondario che caratterizzano le superfici mucosali dei tratti GI e respiratorio; le collezioni di tessuto definite in modo più chiaro sono le placche del Peyer dell intestino e le tonsille faringee. Il secondo accorgimento è il costante controllo del sangue da parte della milza, all interno della quale risiedono APC apposite. Le cellule dendritiche possono ingerire cellule infette o tumorali e presentare gli antigeni di queste cellule ai linfociti T CD8 +. Le cellule dendritiche hanno la speciale abilità di ingerire queste cellule e di presentarne gli antigeni su molecole MHCI: questa via è diversa dalla solita (normalmente le sostanze fagocitate finiscono su MHCII e riconosciute dai CD8+ ) e prende il nome di cross-presentazione Presentazione ai linfociti T differenziati Nell immunità cellulomediata i macrofagi presentano gli antigeni delle cellule fagocitate ai linfociti T differenziati, i quali attivano i macrofagi per uccidere i microbi. I monociti circolanti sono in grado di migrare ai siti di infezione dove differenziano in macrofagi per fagocitare e distruggere i microbi. Le cellule CD4 + amplificano le attività microbicide. Quasi tutti i macrofagi esprimono MHC II a bassi livelli insieme ai costimolanti: questi livelli vengono aumentati dall interferone gamma. Nelle risposte umorali i linfociti B internalizzano gli antigeni proteici solubili e li presentano ai linfociti T helper: questa funzione è necessaria per la produzione di anticorpi dipendente dagli Helper. Tutte le cellule nucleate possono presentare peptidi (derivanti da antigeni proteici citosolici) associati a MHCI e attivare così i linfociti T CD8 + : tutte le cellule nucleate esprimono infatti MHC I. Per il sistema immunitario è fondamentale infatti la possibilità di riconoscere antigeni citosolici contenuti all interno di qualsiasi tipo di cellula. Le cellule endoteliali vascolari esprimono inoltre MHC II e possono presentare antigeni alle cellule T in aderenza alle pareti. 2

3 1.2 Biologia del processamento antigenico Le vie di processamento e presentazione non sfruttano alcun organello cellulare esclusivo: le vie di presentazione, sia MHCI che MHCII, sono dunque adattamenti di funzioni cellulari di base. Gli antigeni proteici presenti nelle vescicole acide delle APC generano peptidi MHCII-associati mentre gli antigeni citosolici generano peptidi MHCI-associati. Questa segregazione delle vie è dovuta alla completa separazione nella biosintesi delle molecole MHCI e MHCII Processamento per la presentazione MHC II La generazione dei peptidi per MHCII a partire da antigeni endocitati prevede la degradazione proteolitica di queste molecole in una serie di step ben definita. Endocitosi delle proteine extracellulari nelle vescicole dell APC Cellule dendritiche e macrofagi esprimono un ampia gamma di recettori superficiali per riconoscere strutture microbiche; in aggiunta i macrofagi esprimono anche recettori per la porzione Fc degli anticorpi e recettori per la proteina C3b del complemento. A seguito dell internalizzazione gli antigeni proteici si trovano localizzati in vescicole intracellulari dette endosomi. Gli endosomi sono vescicole a ph acido che contengono enzimi proteolitici. Processamento delle proteine all interno di endosomi e lisosomi La degradazione delle proteine nelle vescicole è mediata dalle proteasi contenute, le quali lavorano ottimamente al basso ph di queste strutture. Molti enzimi differenti partecipano alla degradazione: le più abbondanti proteasi sono catepsine, enzimi ad ampio spettro d azione. Raramente proteine citoplasmatiche e di membrana possono entrare in questa via: di solito si tratta di digestioni enzimatiche dei componenti citoplasmatici, cioè si tratta di autofagia. In questi casi particolari le proteine vengono intrappolate in vescicole derivanti dal RE chiamate autofagosomi, vescicole fuse poi con i lisosomi. Biosintesi e trasporto di MHCII agli endosomi Le molecole MHC II vengono sintetizzate nel RE e trasportate agli endosomi in associazione ad una proteina detta catena invariante (I i ) che occupa le sedi di legame con il peptide. Le catene α e β delle molecole MHC II vengono sintetizzate in maniera coordinata e si associano tra loro nel RE. I dimeri nascenti sono strutturalmente instabili e il loro folding viene assistito dalle chaperonine. La catena invariante si associa ai dimeri sempre all interno del RE; questa molecola si trova in una posizione tale da impedire alle nuove molecole di legare antigeni eventualmente presenti nel RE. La catena invariante promuove inoltre il folding corretto e dirige le molecole neoformate verso gli endosomi e i lisosomi. Le molecole di MHC II vengono a questo punto secrete dal Golgi all interno di vescicole dirette agli endosomi: queste si fonderanno poi insieme con il risultato che le molecole a questo punto si troveranno nella stessa vescicola che contiene i peptidi generati dalla proteolisi. La fusione delle vescicole porta 3

4 alla formazione di quello che prende il nome di compartimento di classe MHCII o MIIC: questa struttura contiene tutto quello che serve per l associazione peptide-mhc; i contenuti precisi del MIIC sono dunque 1. Enzimi proteolitici 2. Molecole MHCII 3. Catena invariante I i 4. Peptidi di derivazione antigenica 5. Molecola HLA-DM Associazione dei peptidi alle molecole MHC II All interno del MIIC la catena I i viene dissociata grazie all azione di enzimi proteolitici e della molecola HLA-DM: vengono così scoperti i siti di legame e i peptidi si legano. L eliminazione della catena invariante lascia una catena di 24 aminoacidi associata all MHC: questa prende il nome di CLIP ed è ancora in grado di bloccare il legame con i peptidi. La molecola HLA-DM si occupa di eliminare CLIP; questa molecola è codificata all interno del MHC ed è simile alle molecole di classe due ma ha molte differenze: non è polimorfica, non associa la catena invariante e non viene espressa sulla superficie cellulare. In breve HLA-MD è uno scambiatore di peptidi: rimuove clip e facilita la sua sostituzione con il peptide digerito. Le molecole di MHCII presentano una sede aperta di legame peptidico, per questo grandi peptidi o anche proteine intere possono legarsi e venire poi tagliate alla lunghezza giusta per il riconoscimento: il risultato è che normalmente vengono create catene lunghe dai dieci ai trenta aminoacidi. Espressione dei complessi sulla superficie Le molecole di MHC II vengono stabilizzate dal legame con il peptide, e questi complessi vengono indirizzati alla superficie per il riconoscimento: in questo modo solo le MHC II correttamente assemblate possono essere poste all esterno. Alla fine di questa serie di step la cellula presenta moltissimi complessi sulla sua superficie, la maggior parte dei quali presenta proteine self normali: non esiste infatti un meccanismo di riconoscimento del self dal non self in questo ambito. Come è possibile dunque che i linfociti vengano attivati da cellule che mostrano soprattutto molecole self? Questo è possibile perchè i linfociti sono estremamente sensibili: bastano pochissimi riconoscimenti dei complessi giusti, anche meno di cento, per generare una risposta specifica; cento complessi rappresentano meno dello 0,1% di tutti i complessi espressi. Come è possibile però che i linfociti non reagiscano contro le molecole self presentate? Questa seconda proprietà è dovuta al fatto che i linfociti in grado di riconoscere molecole self non esistono normalmente: vengono eliminati durante la fase di maturazione nel timo Processamento per la presentazione MHC I 4

5 I peptidi associati a MHCI sono prodotti per degradazione di proteine citosoliche: trasportati nel RE e assemblati alle molecole MHCI nascenti. vengono poi Fonti di antigeni citosolici Gli antigeni estranei possono essere prodotti virali o di altri microbi intracellulari. Nelle cellule tumorali molti geni possono produrre proteine antigeniche che vengono riconosciute da CTL MHC I ristretti. Degradazione proteolitica delle proteine citosoliche Il meccanismo principale di degradazione è la proteolisi ad opera del proteasoma. Il proteasoma è un complesso enzimatico multiproteico che si trova nel citoplasma della maggior parte delle cellule. Esistono varie forme di proteasoma, uno semplice da sette subunità e 700kD e uno più grande, da 1500kD, probabilmente il più importante per questi scopi. Due subunità catalitiche presenti in molti dei proteasomi da 1500kD sono codificate nel MHC e prendono il nome di LMP2 e LMP7. Il proteasoma ha funzione housekeeping in quanto degrada le proteine danneggiate, non correttamente foldate o ormai inutili: tutte questi bersagli di degradazione vengono marcati dall ubiquitina. L interferone gamma aumenta la trascrizione e la sintesi di LMP2 e LMP7, aumentando dunque l attività del proteasoma: in questo modo aumenta l efficacia della presentazione antigenica. Il fatto che questa via di presentazione sfrutti il proteasoma è un esempio dell adattamento a funzioni immunitarie di strutture già esistenti. In aggiunta al metodo del proteasoma esistono antigeni proteici che apparentemente non richiedono questo enzima e nemmeno ubiquitinazione: probabilmente esistono altre vie non meglio definite che sfruttano direttamente il RE. Trasporto dei peptidi dal citosol al RE Due geni all interno del MHC codificano proteine che mediano il trasporto ATP dipendente di composti a basso peso molecolare attraverso lemembrane cellulari. Questi geni in particolare codificano per due catene di un eterodimero detto trasportatore associato al processing dell antigene (TAP). La proteina TAP si trova sulla membrana del RE dove media il trasporto dei peptidi: l optimum si ha per il trasporto di catene lunghe da sei a trenta aminoacidi, perfette per il legame con l MHC. Sul lato luminale del RE, TAP è legata in maniera non covalente alle neomolecole MHCI da una proteina linker detta tapasina: le molecole di MHC sono dunque nella posizione migliore per ricevere i peptidi. Assemblaggio dei complessi nel RE La sintesi e l assemblaggio delle molecole MHC I sono processi multistep che richiedono il legame con il peptide. Le catene α e β2 vengono sintetizzate nel RE e il folding corretto viene garantito da varie chaperonine. All interno del reticolo i dimeri scarichi rimangono attaccati a TAP grazie alla tapasina; a seguito dell ingresso di un peptide attraverso TAP si ha il taglio di questo a una dimensione corretta da parte di una aminopeptidasi detta ERAP (Endoplasmic Reticulum Amino Peptidase). Il peptide a questo punto lega la molecola MHCI e il complesso viene rilasciato dalla tapasina, esce dal RE e viene trasportato sulla superficie cellulare. In assenza di peptide i dimeri sono instabili e non possono essere trasportati fuori dal RE: vanno probabilmente incontro a degradazione in situ. Espressione superficiale dei complessi I complessi in uscita dal RE vengono mobilitati sulla membrana grazie all esocitosi di vescicole. Una volta posti nella sede definitiva i complessi vengono riconosciuti dai linfociti CD Significato della presentazione in complessi Le vie di presentazione di classe I e II esplorano le proteine disponibili per la presentazione ai linfociti T; la maggior parte di queste proteine sono self: quelle estranee sono relativamente rare. I linfociti esaminano tutte le molecole presentate in cerca di quelle esterne per rispondervi attivamente. Le molecole di MHC controllano sia lo spazio extracellulare che quello citosolico, in quanto i microbi possono risiedere in entrambe le sedi. La presentazione delle proteine vescicolari o citosoliche da parte dell MHC II o I rispettivamente determina quale sottogruppo delle cellule T risponderà a quei determinati antigeni. Gli antigeni extracellulari seguono solitamente il pathway dell MHC II e attivano quindi i linfociti T CD4 + : queste cellule 5

6 funzionano come aiutanti per stimolare i meccanismi effettori, quali anticorpi e fagociti. Gli antigeni intracellulari invece sono inaccessibili ad anticorpi e fagociti e stimolano una via diversa: vengono caricati su MHC I e stimolano i linfociti T CD8 +, la cui funzione è uccidere la cellula che li ha attivati. Questa via garantisce che qualsiasi cellula, poichè MHC I viene espresso in ogni cellula nucleata, possa impedire la diffusione di microbi facendosi eliminare dal sistema immunitario. La specificità dei linfociti T è essenziale alle loro funzioni, in gran parte mediate da interazioni dirette tra cellule o da citochine a breve raggio. Le APC non solo presentano gli antigeni ai linfociti T ma sono anche il bersaglio delle loro funzioni effettrici: ad esempio i macrofagi presentano l antigene ai CD4 + i quali li attivano consentendo loro di distruggere il microbo. Le molecole di MHC determinano l immunogenicità di un antigene in due modi: Immunodominanza. Gli epitopi di proteine complesse che generano una risposta più forte nelle cellule T sono i peptidi generati dalla proteolisi nelle APC e che legano più avidamente le molecole di MHC. In un individuo esposto a un antigene proteico multideterminante la maggior parte delle cellule T sarà specifica verso uno o due sequenze aminoacidiche dette epitopi immunodominanti. Responsività immunitaria geneticamente controllata. L espressione di particolari alleli MHC II in un individuo ne determina la capacità di rispondere a particolari antigeni. I geni della risposta immunitaria che controllano le risposte anticorpali sono infatti parte dell MHC II e determinano la capacità di risposta in quanto cambia la capacità di legare i diversi peptidi antigenici. 1.4 Presentazione di antigeni lipidici delle molecole CD1 Rare popolazioni di linfociti T, detti cellule NK-T, sono in grado di riconoscere antigeni lipidici e glicolipidici. Questi linfociti hanno parecchie proprietà strane, ad esempio marker caratteristici sia delle cellule T che delle NK, e poca diversità nei loro recettori per gli antigeni. Le cellule NK-T riconoscono lipidi e glicolipidi presentati sulla molecola simil MHCI detta CD1. Esistono molte varianti di questa molecola, ma seguono tutte la stessa via di presentazione. Le molecole neosintetizzate caricano lipidi cellulari e li portano sulla superficie cellulare; da qui i complessi CD1- lipide vanno incontro ad endocitosi in endosomi e lisosomi: le molecole CD1 acquisiscono dunque lipidi antigenici durante il riciclo e li presentano senza apparente processamento. Le cellule NK-T svolgerebbero un ruolo in particolare nella difesa dai micobatteri. 6