Attività elettrica dei neuroni. Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti

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1 Attività elettrica dei neuroni Neuroni piramidali del SNC che stanno crescendo su una matrice di glia/fibroblasti

2 Un esperimento in current-clamp Si inietta una corrente I di intensità nota nella cellula e si misura la conseguente variazione del potenziale di membrana V m Quindi, ad ogni valore della corrente iniettata possiamo associare un determinato valore di V m

3 Riportiamo in un grafico i valori ottenuti: Riportiamo adesso sullo stesso grafico altri valori ottenuti da un altra cellula: Corrente (na) Corrente (na) Qual è la differenza? Pot. di Membrana (mv) La relazione corrente/voltaggio è lineare, come c è da aspettarsi se vale la legge di Ohm: I=g V m dove g = costante Pot. di Membrana (mv) In questo caso la relazione corrente/voltaggio non è lineare, quindi non vale la legge di Ohm: I=g V m cioè g costante

4 Alcuni tipi di canali Ionici sono sempre aperti, altri no! extracell. intracell. Sempre aperti Voltaggio-dipendenti: rispondono a variazioni di V m Il loro comportamento è ohmico: la relazione I/V è lineare g=costante Il loro comportamento non è ohmico: la relazione I/V non è lineare perché g non è costante [g=f(v m )]

5 Riassumendo Se sulla membrana esistono canali voltaggio-dipendenti, le variazioni del potenziale di membrana V m in risposta ad uno stimolo elettrico dipendono: oltre che dal tempo necessario a caricare la membrana, che si comporta come un condensatore (proprietà passive di membrana), anche dal fatto che g m varia al variare del voltaggio e del tempo, g m =f(v,t) (proprietà attive dei canali). Il metodo di indagine del current-clamp non permette di separare la componente resistiva della corrente (I R ), dovuta alla presenza di canali ionici, da quella capacitiva (I C ), dovuta al comportamento della membrana come un condensatore

6 La derivazione delle correnti ioniche transmembranarie amplificatore Neurone piramidale con un elettrodo di vetro attaccato per la derivazione delle correnti ioniche transmembranarie mediante la tecnica del (patch-) voltage-clamp

7 La tecnica del voltage-clamp consiste nel bloccare il potenziale di membrana ad un valore costante nel tempo e nel registrare le correnti ioniche transmembranarie generate a tale potenziale di membrana 2 (mv) Potenziale di membrana finale (V m ) costante Potenziale di riposo (V r ) Corrente ionic ca (na) Corrente transmembranaria generata dal passaggio di V m da 7 mv a +2 mv Vantaggi del voltage-clamp: In genere, g m = f(v,t) ma, 1. V m è bloccato ad un valore costante g m = f(t) soltanto e può essere dedotto dall andamento della corrente ionica I i 2. E possibile separare I i da I c. Infatti c m è caricata istantaneamente

8 Separazione farmacologica delle correnti I K e I Na Voltaggio (mv) Corrente ionica (na) TTX (I K ) I Na +I K + TEA (I Na )

9 Voltaggio-dipendenza dei canali K v Voltaggio (mv) I(K + ) max (na) I K =g K (V-E K ) Voltaggio (mv) Corrente K + (na) Conduttanza (µs) g K = I K /(V-E K ) E K =-8 mv Voltaggio (mv)

10 Quesito del giorno Un ricercatore, in seguito ad esperimenti condotti in voltageclamp ha ricavato che la corrente di K + (I K ) dipende dal potenziale di membrana (V) secondo la seguente relazione: I K = ( V + 85) 1 ( V + + 1) / 1 e 9 (pa) 1) Calcolare i valori di I K nell intervallo di potenziali tra 8 e +8 mv ad intervalli di 1 mv e metterli in grafico in funzione di V; 2) Dai valori di I K ricavati, e sapendo che E K = -85 mv, calcolare i valori corrispondenti di g K e metterli in grafico in funzione di V; 3) A quale valore di V sara aperta la meta dei canali?

11 I K = 4.6 [1-1/(1+EXP((V+1/9))] (V+85) (pa) E K = -85 mv V m I K V m-e K g K mv pa ns mv

12 Voltaggio-dipendenza dei canali Na Voltaggio (mv) I(Na) (na) I(Na) (na) Conduttanza (µs) I(Na) picco (na) Voltaggio (mv) Voltaggio (mv) I Na =g Na (V-E Na ) g Na = I Na /(V- E Na ) E Na =+5 mv

13 A parità di conduttanza, è la driving force che determina l'andamento della relazione I/V E A =+55mV E B =-8mV V m g (ns) V m-e A I A (pa) V m-e B I B (pa) E A =+55mV E B =-8mV Corrente (pa) Voltaggio (mv)

14 Quesito del giorno Un ricercatore, in seguito ad esperimenti condotti in voltageclamp e utilizzando la tossina di scorpione per bloccare l inattivazione, ha ricavato che la conduttanza del canale del Na + (g Na ) dipende dal potenziale di membrana (V) secondo la seguente relazione: g Na e 1 = 5 ( V + 3) / 6 (ns) 1) Calcolare i valori di g Na nell intervallo di potenziali tra 8 e +8 mv ad intervalli di 1 mv e metterli in grafico in funzione di V; 2) Dai valori di g Na ricavati, e sapendo che E Na = +55 mv, calcolare i valori corrispondenti di I Na e metterli in grafico in funzione di V.

15 g Na =5.6(1-1/[1+EXP((V+3)/6)]) (ns) E Na =+55 mv ns V m g Na (ns) V m -E Na I Na (pa) mv 2 pa mv

16 Canali voltaggio-dipendenti - CINETICA - Il movimento termico fa oscillare la proteina-canale tra la conformazione aperta e quella chiusa Quindi, questa transizione Chiuso Aperto è un evento casuale La legge delle probabilità ci permette tuttavia di fare certe predizioni sul comportamento medio del canale

17 Come esempio consideriamo un canale che ha soltanto uno stato chiuso e uno stato aperto. Closed α u.d.m: s -1 Open β Calcolo della Probabilità di apertura (P o ) dp O /dt = αp C βp O dp C /dt = βp O - αp C P O + P C = 1 P C = 1 - P O dp O /dt = α αp O βp O dp O /dt = α (α + β)p O

18 Risolvendo l equazione differenziale e ponendo P O (t)=n(t), si ottiene: n(t) = α/(α + β) α/(α + β)exp[ (α + β)t]+α /(α + β )exp[ (α + β)t] si ottiene: In particolare, all'equilibrio: dp O /dt = α - (α + β)p O = P O eq = α/(α + β) = n Ponendo inoltre α /(α + β ) = n e 1/(α + β) = τ n(t) = n - (n - n ) exp( t/τ) Essa rappresenta la relazione tra le costanti di velocità e, a livello microscopico: la probabilità che un singolo canale con un unica gate sia aperto, a livello macroscopico: la frazione di canali (unica gate) aperti

19 Cinetica delle correnti di K + del canale K v Voltaggio (mv) Ipotesi: una sola gate P o =n(t)=n -(n -n ) exp(-t/τ) I(K) Prob. di apertura (P o ) I=g (V-E) ; g P o I(t) n(t) (V-E) I=g (V-E) ; g P o =n 4 I(t) n4 (t) (V-E)(V-E) gate 4 gates chiuso -7mV aperto +6mV Ipotesi: quattro gates identiche P o = n n n n = n 4 n 4 (t)=[n -(n -n ) exp(-t/τ)] chiuso aperto

20 Cinetica delle correnti di Na + voltaggio-dipendenti Volt. (mv) Ipotesi: tre gates identiche P o =m 3 (t)=[m -(m -m ) exp(-t/τ)] 3-5 Prob. di apertura (P o ) I(Na) m(t) h(t) m 3 (t) m 3 *h Chiuso -7mV Chiuso -7mV Aperto +2mV Aperto +2mV Ipotesi: tre gates identiche di attivazione + una gate di inattivazione P o =m 3 (t) h(t) Inattivato +2mV

21 Quesito del giorno Depolarizzando un neurone dal potenziale di riposo V o ad un certo potenziale V f =+1 mv, la probabilita di apertura di una singola gate di attivazione n del canale del K + varia nel tempo seguendo la seguente relazione temporale: n(t) =.8 [1- EXP(-t / 1.1) ], dove il tempo t e espresso in ms. Sapendo che quel tipo di canale del K + ha 4 gates n identiche e che la conduttanza massima G K e 25 ns: 1. calcolare e mettere in grafico i valori della conduttanza g K (t) ad intervalli di 1 ms per una durata totale di 12 ms; 2. calcolare il valore di I K allo stato stazionario (E K = -8 mv).

22 n(t) =.8 [1- EXP(-t / 1.1) ] E K =-8 mv G K =25 ms g=g n 4 I K = g (V-E K ) = G n 4 (V-E K ) t(ms) n n 4 g (ns) IK (pa)

23 Ancora un problema Il potenziale di riposo di una cellula è determinato dalla presenza di due canali permeabili rispettivamente agli ioni A e B attraverso i quali passano le correnti I A e I B indicate in tabella. Dopo aver disegnato i rispettivi grafici I/V, determinare: 1) le conduttanze g A e g B ; 2) se i due canali sono voltaggio-dipendenti o -indipendenti; 3) il potenziale di equilibrio dei due ioni A e B; 4) il potenziale di riposo V r della cellula. V(mV) I A (na) V(mV) I B (na)

24 V(mV) I A =g A (V-E A ) (na) V(mV) I B =g B (V-E B ) (na) E A E B E A =-9mV E B =+4mV g 1A =I[(-12)-I(-11)]/[-12-(-11)]= 55 ns g 1B =I[(-2)-I(-1)]/[-(-1)]= 22 ns V r =(E A g A +E B g B )/(g A +g B )= mv

25 Confronto della voltaggio-dipendenza di g K e g Na 1..8 ttanza g Condut V m (mv)