Diss ETH presented. Accepted. dipl. CHARACTERISTICS OF CARDIAC SARCOPLASMIC. Michele Pietro Chiesi. citizen of Giubiasco, Ticino

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Agnella Brunelli
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1 Diss ETH 6186 CHARACTERISTICS OF CARDIAC SARCOPLASMIC RETICULUM AND OF ITS Ca PUMPING ENZYME: A COMPARATIVE STUDY WITH FAST SKELETAL MUSCLE. A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH For the degree of Doctor of Natural Science presented by Miche Pietro Chiesi dipl. Biochem. ETH born: August 7th, 1950 citizen of Giubiasco, Ticino Accepted on the recommendation of Prof. Dr. E. Carafoli, referee Prof. Dr. H. Eppenberger, coreferee 1978

2 9 ABSTRACT A method for the purification of highly active membranes mainly derived from dog cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) has been developed. From the gectrophoretic patterns it is evident that these membranes are devoided of the Ca binding protein, calsequestrin, normally present in sketal musc preparations. The differences in the Ca depen dent activities observed between fast sketal and cardiac musc SR have been found to be temperaturedependent and seem to be due, at ast in part, to the differences in the hydrophobic milieu surrounding the (Ca^ Mg )ATPase enzyme in the membranes, obtained from the different tissues. How ever, the existence of an intrinsic physicochemical dissi milarity of the Capumping mocus in the various tis sues, has been investigated. (CaMg)ATPases from car diac and fast sketal musc SR have been isolated and pu rified. All the characteristics analyzed have been found to be similar if not identical; these are: Caionophoric ac tivity, kinetic of channel formation, sulphydryl content and ro of sulphydrylgroups in the Cadependent activities, characteristics of the tryptic fragments obtained with con trold proteolysis. From these results it is suggested that the differences observed in the functional activities of the SR membranes of the two tissues could mainly be due to differences in SR proteins other than the Ca pumping enzyme (i.e., such as regulatory and Cabinding proteins) and/or in the phospholipidic composition of the membrane, and in addition, in the relative development of the SR membranes in the two tissues.

3 il la 116 SOMMARIO II movimento degli ioni calcio nella cellula muscolare possono essere regolati da diversi tipi di membrana. II contribute dato dal reticolo sarcoplasmico (RS) varia a seconda dei tipi di muscolo. Non ancora stato stabilito se queste variazioni (p.es. fra muscolo schetrico e car diaco) siano solamente quantitative oppure anche qualita tive, ossia, se siano devute anche a meccanismi diversi per l'accumulo ed il relascio del calcio dal RS. II primo scopo di questa tesi stato quello di chiarire i punti fondamentali di divergenza fra la composizione proteica e lipidica ed inoltre, fra attivits. enzimatiche Ca dipendenti del membrane di RS, isolate da muscolo sche trico e cardiaco. I punti fondamentali elucidati da questa ricerca sono: principa costituente proteico di entrambe preparazioni 6 l'enzima (CaMg)ATPasi (100,000), composizione lipidica del membrane isolate dai due tipi di tessuto ggermente diversa; inoltre la preparazione di cuore non contiene una proteina (calsequestrina) che ha la importante funzione di gare grandi quantita" di Ca e che normalmente presente muscolo schetrico, nel RS di attivith enzimatiche Ca dipendenti del due preparazioni sono parzialmente differenti e soprattutto mostrano una diversa dipendenza dalla temperatura. Sembra che questo sia dovuto, almeno in parte, all' ambiente. idrofobico in cui si trovano gli enzimi ATPasici, il qua S diverso nei due tessuti. La possibility di una differenza intrinsica del caratteristiche degli enzimi ATPasi dei due tessuti % stata analizzata. L1 enzima (CaMg)ATPasi stato isolato e purificato in una forma attiva da entrambi i tipi di mem

4 brana. Risultati essenzialmente identici sono stati ottenuti dagli studi comparativi seguenti: ATPasi, incorporate in membrane artificiali ("black film"), mostrano una attivita' ionoforica con una settivita caratteristica. Inoltre, da uno studio del fluttuazioni della corrente ionica, indotta dagli enzimi, risulta che l'aumento della permeabilita della membrana e dovuto alia formazione di canali settivi per certi tipi di cationi che rimangono sempre aperti. gruppi sulfidrilici per mo di ATPasi vengono alchilati dal reagente Netilmaimide (NEM) con una conseguente inibizione del attivita enzimatiche Cadipendenti. In presenza di 1 mm ATP, un gruppo SH viene protetto dall'attacco del reagente e ATPasi rimangono attive. Uno studio cinetico della inibizione da NEM dell' attivita ATPasica Cadipendente, in assenza di ATP, sembra indicare che ATPasi contengono un unico gruppo sulfidrilico, il qua e indispensabi per 1'attivita catalitica. ATPasi, riconstituite in vescico monolamellari, so no state sottoposte a tripsinizzazione e seguenti caratteristiche sono state osservate: i) speciali condizioni sperimentali sono richieste per ottenere un'azione proteolitica controllata ii) con suddette condizioni, attivita ATPasiche Cadipendenti sono mantenute nei prodotti proteolitici, iii) i frammenti triptici hanno un peso mocolare simi iv)il sito attivo del ATOasi e stato identificato e localizzato nei medesimi frammenti triptici

5 differenze differenze alio 118 Sulla base di questi risultati viene concluso che ATPasi del RS di muscolo schetrico e cardiaco sono molto simili se non identiche. Le differenze osservate nel attivita en zimatiche Ca dipendenti possono essere dovute principalmente a: in altri componenti proteici del membrane di RS come, ad esempio, proteine regolatrici o proteine in grado di gare Ca (vedi calsequestrina), nella composizione lipidica del membrana e/o nel grado di saturazione del catene alifatiche dei fosfolipidi (vedi ad esempio l'effetto dell' Eavitaminosi sulla perossidazione dei lipidi e sull' attivita enzimatica del RS), scarso sviluppo del membrane del RS nel muscolo di cuore rispetto al muscolo schetrico.

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