L esperimento di Griffith sulla trasformazione genetica in pneumococco.

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2 L esperimento di Griffith sulla trasformazione genetica in pneumococco.

3 La natura chimica del materiale genetico

4 ACIDI NUCLEICI DNA : deposito informazioni RNA: a) espressione informazione (es. sintesi proteica) b) alcuni virus: deposito inform. genetica

5 FORMAZIONE DEL LEGAME FOSFODIESTERICO

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9 avvolgimento dimin. la distanza 1 giro = 10 coppie nucleotidi passo spirale = 3.4 nm diametro = 2 nm si appaiano 1 purina e 1 pirim. A + G = T + C doppia elica stabilizzata da: a) legami H tra coppie di basi complementari b) interazioni Van der Waals tra basi sovrapposte Semplice modello per la replicazione facile riparazione

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11 A-DNA: DNA disidratato. Possiede una struttura più corta e più larga di quella del DNA-B, con solchi maggiori più larghi e solchi minori più piccoli.

12 B-DNA: Come originalmente previsto da Watson e Crick (1952), il DNA possiede una doppia elica destrorsa e uno scheletro zucchero-fosfato molto regolare. Il DNA-Z possiede una conformazione sinistrorsa e uno scheletro irregolare, come mostrato dalle linee blu che presentano un andamento a zig-zag da gruppo fosfato a gruppo fosfato, lungo i filamenti. E stato proposto un ruolo nella replicazione, ricombinazione genetica e regolazione della trascrizione.

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14 DNA Dimensioni e forma

15 DNA Dimensioni e forma Zone non codificanti (DNA spaziatore) Sequenze ripetute (no informazione) Batteri: 1 cromosoma circolare immerso nel citoplasma Eucarioti: più cromosomi nel nucleo; il numero e le dimensioni sono caratteristici di ogni specie. Piccole quantità DNA nei mitocondri e cloroplasti superavvolgimenti

16 Agenti fisici e chimici Denaturazione e rinaturazione DNA In soluzione strutt. disordinata Denaturazione modif. proprietà fisico-chimiche (aumento assorb. UV effetto ipercromico) no inform genetica Temperatura di fusione Circa C; varia a seconda delle basi Ibridazione ac. nucleici: (ingegneria genetica ) sequenze compl. si rinaturano anche se 1 di DNA e 1 di RNA

17 Spettro di assorbimento del DNA agli UV (260 nm) a causa dell assorbimento a questa λ, da parte delle basi

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20 Un profilo di denaturazione termica del DNA.

21 Relazione fra temperatura di fusione e composizione in basi del DNA.

22 Denaturazione e rinaturazione del DNA.

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24 RNA Classificazione e proprietà degli RNA

25 DNA del batteriofago PM2. Interconversione fra DNA rilassato e superavvolto.

26 Esempio di enzima di restrizione (da E. coli) : EcoRI: 5 G-A-A-T-T-C 3 3 C-T-T-A-A-G 5 (Estremità coesive)

27 Gel elettroforesi del DNA Campioni ottenuti con incubazione con enzimi di restrizione: enzimi isolati dai batteri che tagliano le molecole di DNA a livello di siti specifici frammenti di restrizione. I siti di restrizione sono per ogni enzima di restrizione.

28 Mappa di restrizione

29 I didesossiribonucleotidi (nucleotidi che al 3 non posseggono il gruppo ossidrile) interferiscono con la normale sintesi del DNA. Il sequenziamento del DNA è applicato ai geni, ma anche a genomi completi: progetto genoma umano (Dulbecco)

30 Rinaturazione del DNA. La frazione del DNA di timo di vitello che rinatura più rapidamente è formato da sequenze ripetute.

31 DNA ripetuto in tandem: 10-15% del genoma di mammifero. Differiscono per lunghezza della unità di ripetizione e n di volte che essa si ripete. L unità di ripetizione può possedere qualsiasi lunghezza compresa fra 1 e circa 2000 basi. DNA ripetuto a sequenza semplice più corta di 10 cb. Formano CENTROMERI e TELOMERI. DNA satellite: blocchi di cb. DNA minisatellite: DNA satellite presente in blocchi più corti: cb. DNA microsatellite (1-4 cb è la lunghezza della unità di ripetizione) e sono presenti in blocchi di cb per sito. Le corte sequenze ripetute sono contenute nei mini- e microsatellite sono utili in lab. per la derivazione del DNA fingerprint. Parecchie malattie genetiche sono dovute al cambiamento di dimensione del blocco di alcuni DNA microsatellite : sindrome X fragile, distrofia miotonica. Sequenze ripetute intersperse: le unità di ripetizione non sono organizzate in blocchi ma distribuite singolarmente nel genoma % del genoma. Sono forse elementi trasponibili: segmenti di DNA che possono muoversi all interno del genoma.

32 I nucleosomi.

33 Evidenza che nelle fibre cromatiniche le proteine sono raggruppate lungo la molecola di DNA ogni 200 cb.

34 Evidenza dell esistenza dei nucleosomi. La cromatina che è stata parzialmente degradata dal trattamento con la nucleasi di micrococco è frazionata mediante centrifugazione in gradiente di densità (parte centrale della figura). I picchi individuali sono stati analizzati sia con la microscopia elettronica (in basso), sia in gel elettroforesi dopo rimozione delle proteine (in alto). Il picco sulla destra è costituito da singole particelle proteiche associate con 200 coppie di basi di DNA; il picco in mezzo consiste di due particelle associate a 400 coppie di basi di DNA, e il picco sulla sinistra è costituito da tre particelle associate con 600 coppie di basi di DNA. Questo risultato indica che nella cromatina l unità di ripetizione di base è costituita da una particella proteica associata con 200 coppie di basi di DNA.

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36 Cromatina e cromosomi DNA Istoni (prot. basiche) Non istoni (acide) Controllo trascrizione Istoni: prot. ricche in arginina e lisina Cariche positiv. per evitare che le cariche (-) delle 2 semieliche DNA si destabilizz. 2H 2 A, 2H 2 B, 2H 3, 2H 4 Ottamero Nucleosoma: compattamento 11 nm non suff. I vari nucleosomi sono collegati fra loro da DNA linker Collana di perle Core 146 coppie di basi si avvol.in senso antiorario Atre 20 coppie di basi: (10 entrano e 10 escono dal rocchetto) Aderiscono ad H 1 Compattamento 30 nm Compattamento 11 nm Stabilità filam. intorno al core Avvicinamento e stabilità solenoide

37 Livelli di impacchettamento della cromatina

38 Cromatina e cromosomi Nucleo interfasico Sotto membr. nucleare Cromatina fortem. addensata In altre zone nucl. Cromatina non addensata Eterocromatina inattiva Eucromatina Cromosomi Visibili dopo la fase S costitutiva facoltativa 1 cromosoma DNA altamente ripetitivo DNA che può decondensarsi Costrizione II aria 2 cromatidi uniti dal centromero Costrizione I aria

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41 La microscopia elettronica permette di evidenziare le proteine dell impalcatura (scaffold) che rimangono dopo che dai cromosomi umani sono stati rimossi gli istoni.

42 Il DNA mitocondriale. La molecola mostrata è nell atto della replicazione; le frecce indicano i punti in cui la replicazione sta avvenendo.

43 Genoma del mitocondrio umano. Genoma del mitocondrio umano.

44 Il nucleoide batterico. La fotografia al m.e. a destra, mostra che il DNA rilasciato forma una serie di anse che rimangono attaccate ad una rete strutturale presente all interno del nucleoide.

45 Nucleo

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47 Il nucleo è il centro di controllo della cellula Il nucleo è organulo sferoidale (Ø 5 µm) più grande ed è separato dal citoplasma tramite l involucro nucleare. l involucro nucleare è formato da 2 membrane formate da doppi strati fosfolipidici e proteine, presenta pori ed è in continuità col RE. Il nucleo è il centro di controllo genetico della cellula eucariotica perché contiene il DNA che dirige tutte le attività cellulari. Nucleolo Poro Cromatina Nucleo Membrana nucleare a doppio strato Il N di cromosomi è tipico di una specie (es 46 nell uomo) Figura 4.7 Ribosomi Reticolo endoplasmatico ruvido

48 DINAMICITA STRUTTURALE DELL INVOLUCRO NUCLEARE Durante la divisione nucleare (mitosi) l involucro nucleare si dissolve per poi riformarsi mitosi aperta

49 L organizzazione strutturale del nucleo e dell involucro nucleare.

50 I pori nucleari. Il piano della frattura rivela le superfici delle membrane nucleari interna (A) ed esterna (B). Le sporgenze evidenziate dalle frecce rappresentano lo spazio perinucleare delimitato dalle due membrane.

51 La struttura del poro nucleare. Complesso del poro nucleare (NPC) Punto di fusione tra le due membrane Simmetria ottagonale Trasportatore o tappo centrale Unica via comunicazione tra nucleo e citoplasma

52 Il passaggio delle molecole attraverso il poro nucleare avviene (sia in entrata che in uscita dal nucleo) attraverso due meccanismi: uno di diffusione facilitata (per molecole di P.M. < 20 KDa) e l altro di trasporto attivo (per proteine e RNA). In quest ultimo caso il poro può allargarsi fino a 25 nm ed è selettivo per le macromolecole in entrata (proteine) e in uscita (subunità ribosomiali).

53 Traffico macromolecolare controllato dentro e fuori dal nucleo. RNA, ribosomi e proteine Passaggio controllato (facilitato o ostacolato) a livello del poro nucleare Trasporto passivo di piccole molecole attraverso i pori ( < 10 nm), proteina globulare di PM D. Trasporto attivo di grosse proteine e di RNA. Le proteine hanno sequenze segnale di localizzazione nucleare (NLS): 8-30 Aa e contiene prolina, lisina e arginina (pos.)

54 Un meccanismo proposto per spiegare il trasporto delle proteine dal citoplasma nel nucleo.

55 Le proteine lamìne formano il nucleoscheletro nella matrice nucleare (nel nucleoplasma) e la lamina nucleare (reticolo fibroso appena sotto l involucro membranoso) : strutture proteiche di sostegno al nucleo (laminopatie umane DIFETTI GENETICI A CARICO DELLE LAMINE)

56 Versante esterno dell involucro nucleare è rivestito da actina. Connessione tra cito- e nucleoscheletro

57 La matrice nucleare è una fitta rete di sostegno a cui si associano cromosomi ed enzimi

58 La matrice nucleare e la lamina nucleare sono strutture di sostegno del nucleo.

59 Nucleo Doppia membrana: pori Ø 10 nm passano solo molec. < 10 nm Membrana ext: ribosomi sintesi proteine verso membr.plasm. spazio intermembr. Quindi Membrana nucl. funz. tipiche RER Membrana int. externam.: ribosomi internam.: filamenti prot. Lamina Matrice nucleare: fitta rete di fibre, all interno anche actina Teoria nucleoscheletro: organizza spazialm. enzimi e fibre DNA connesso con citoschel. matr. extrac. annulus

60 Nucleolo : zona densa Sito di trascrizione e maturazione degli rrna assemblaggio di subunità ribosomali Contiene porzione fibrillare (RNA) e granulare (proteine ribosomali+rna)

61 I nucleoli possono essere più di uno, a seconda dello stato celluare

62 Il nucleolo si trova associato alle regioni di DNA con i geni per l rrna o nucleolar organization region (NOR)

63 Regione fibrillare Regione granulare Nucleolo Si organizza in seguito all attività di quelle porzioni di cromatina che formeranno la costrizione IIaria Tratti DNA Organizzatore nucleolo Organizzatori nucleolari Gran quantità RNA Zona fibrillare Traduzione Nel citoplasma Si assembla conproteine Zona granulare Sub. ribosomi Trasp. attivo Attraversano i pori nucleari

64 Per dimostrare il ruolo del nucleolo nella sintesi di RNA, in un animale da laboratorio è stata iniettata la H 3 -uridina, un precursore della sintesi dell RNA. Dopo 5 ore, il tessuto epatico è stato prelevato e sottoposto ad autoradiografia. La presenza di grani scuri sopra ai nucleoli indica che il trizio (H 3 ) è concentrato in queste strutture.