POLITECNICO DI BARI Corso di Laurea Magistrale in Ingegneria Elettronica BIOINFORMATICA DNA COMPUTING Docente Prof. Giuseppe Mastronardi

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1 POLITECNICO DI BARI Corso di Laurea Magistrale in Ingegneria Elettronica BIOINFORMATICA DNA COMPUTING Docente Prof. Giuseppe Mastronardi

2 Sommario Introduzione Cenni di biologia Modello di Adleman Modello di Lipton Implementazione Conclusione

3 Introduzione - Agli inizi del Novecento è iniziata la prima vera indagine sulla natura del mondo microscopico che si è rivelato molto più elusivo di quanto si potesse immaginare e profondamente diverso dal mondo macroscopico di cui ci si è fatto un preciso modello. - Uno dei più grandi fisici di quegli anni, Richard Feynman, in uno straordinario discorso tenuto nel 1959, aveva già delineato le incredibili prospettive del progressivo processo di miniaturizzazione in atto nella tecnologia ed aveva ipotizzato che fosse possibile arrivare a costruire dispositivi di varia natura utilizzando individualmente persino gli stessi atomi. - La miniaturizzazione dei componenti ha però un limite fisico, non si può andare sotto le dimensioni atomiche. Una volta raggiunto tale limite, per ottenere un ulteriore aumento delle prestazioni del calcolatore elettronico, si rende necessario cambiare radicalmente tecnica. Molto lavoro di ricerca si sta sviluppando in tale direzione e si stanno profilando almeno due ipotesi molto promettenti: i quantum-computer ed i DNA-computer.

4 Cenni di biologia (1/6) DNA = DeoxyriboNucleic Acid - Il DNA è una macromolecola formata da due lunghi filamenti uniti tra loro come lo sono i montanti di una scala collegata dai pioli. Gli elementi di costruzione del DNA sono monomeri, detti nucleotidi, ognuno dei quali contiene tre parti: uno zucchero a cinque atomi di carbonio (il deossiribosio), un gruppo fosfato e una base azotata (cioè contenente azoto). - I nucleotidi del DNA contengono lo stesso tipo di zucchero e di gruppo fosfato, ma differiscono per la base azotata. Ci sono quattro diversi tipi di basi: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T); si osserva che nei filamenti di RNA la timina è sostituita dall uracile (U).

5 Cenni di biologia (2/6) CODONI = triplette di nucleotidi - Le 4 basi azotate del DNA (A, T, C, G) costituiscono l alfabeto genetico, mentre ogni unità del codice genetico è una sequenza di 3 basi azotate che prende il nome di codone. Ad esempio, il filamento di RNA UUUACACAG si compone di 3 codoni, UUU, ACA e CAG, a cui corrispondono rispettivamente gli amminoacidi fenilalanina, treonina e glutammina. Una catena di DNA costituita da diverse centinaia di codoni può formare, usando solo i 4 nucleotidi, il codice per una proteina complessa. - Prendendo le 4 basi azotate a gruppi di 3 si possono ottenere 64 combinazioni differenti (infatti 4 3 =64); in natura, però, esistono solo 20 amminoacidi nelle proteine ed è pertanto evidente che alcuni amminoacidi vengono indicati da più di un codone. La ridondanza rende il codice genetico meno vulnerabile alle mutazioni casuali.

6 Cenni di biologia (3/6) CODONI = triplette di nucleotidi codifica dei codoni seconda base U C A G prima base U C A UUU fenilalanina UUC fenilalanina UUA leucina UUG leucina, start CUU leucina CUC leucina CUA leucina CUG leucina, start AAU isoleucina, start AUC isoleucina AUA isoleucina AUG metionina, start UCU serina UCC serina UCA serina UCG serina CCU prolina CCC prolina CCA prolina CCG prolina ACU treonina ACC treonina ACA treonina ACG treonina UAU tirosina UAC tirosina UAA ocra, stop UAG ambra, stop CAU istidina CAC istidina CAA glutammina CAG glutammina AAU asparagina AAC asparagina AAA lisina AAG lisina UGU cisteina UGC cisteina UGA opale, stop UGG triptofano CGU arginina CGC arginina CGA arginina CGG arginina AGU serina AGC serina AGA arginina AGG arginina G GUU valina GUC valina GUA valina GUG valina, start GCU alanina GCC alanina GCA alanina GCG alanina GAU acido aspartico GAC acido aspartico GAA acido glutammico GAG acido glutammico GGU glicina GGC glicina GGA glicina GGG glicina

7 Cenni di biologia (4/6) CODONI = triplette di nucleotidi codifica inversa Sigla Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val start stop Nome alanina arginina asparagina acido aspartico cisteina glutammina acido glutammico glicina istidina isoleucina leucina lisina metionina fenilalanina prolina serina treonina triptofano tirosina valina amminoacidi di start amminoacidi di stop Codoni GCU, GCC, GCA, GCG CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG AAU, AAC GAU, GAC UGU, UGC CAA, CAG GAA, GAG GGU, GGC, GGA, GGG CAU, CAC AUU, AUC, AUA UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG AAA, AAG AUG UUU, UUC CCU, CCC, CCA, CCG UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC ACU, ACC, ACA, ACG UGG UAU, UAC GUU, GUC, GUA, GUG AUG, GUG UAG, UGA, UAA

8 Cenni di biologia (5/6) Alcune tecniche di biologia molecolare - Separazione (melting): divisione di una molecola o di un frammento di DNA nei due filamenti complementari che lo costituiscono; tale operazione si effettua creando delle adeguate condizioni di temperatura, acidità, ecc. per rompere il debole legame idrogeno fra le basi azotate. - Accoppiamento (annealing): unione di due filamenti di DNA complementari ottenuta raffreddando la soluzione ed aggiungendo l enzima ligasi per favorire il processo e rendere più stabili gli accoppiamenti. - Separazione o estrazione per affinità: è una tecnica che permette di estrarre dei filamenti di DNA che hanno dei sottofilamenti con particolari configurazioni (pattern), basandosi sul principio di complementarietà delle basi. - Sintesi artificiale del DNA: permette di sintetizzare in laboratorio molecole di DNA con una sequenza desiderata fino a 100 nucleotidi, in breve tempo e a costi contenuti; inoltre con questa tecnica è possibile sintetizzare sequenze casuali di nucleotidi ancora più lunghe.

9 Cenni di biologia (6/6) Alcune tecniche di biologia molecolare - Amplificazione: produzione di copie di un filamento di DNA mediante la reazione a catena della polimerasi. È necessario l utilizzo dell enzima DNA-polimerasi per replicare un filamento di DNA: l enzima legge il filamento e sceglie da una miscela di basi azotate presenti in soluzione quale inserire seguendo la regola della complementarietà. La reazione consiste nella duplicazione a catena di un filamento iniziale di DNA, per cui dopo n cicli si saranno prodotte 2 n copie del filamento di partenza. - Elettroforesi su gel: è una tecnica che permette di separare i filamenti di DNA sulla base della loro lunghezza. Consiste nel mettere la soluzione contente il DNA in un pozzetto all estremità di un sottile strato di gel a cui viene applicata una corrente elettrica; quindi le molecole di DNA verranno attirate verso l anodo perché possiedono una carica negativa. La caratteristica fondamentale di questa tecnica è che le velocità di migrazione all anodo per le molecole più corte è maggiore rispetto a quella delle molecole più lunghe; questo determina la formazione di un tracciato. Il sistema così ottenuto si può osservare utilizzando particolari reagenti ed illuminando il gel con luce ultravioletta; inoltre è possibile calcolare esattamente il peso molecolare di ciascun frammento separato con una semplice tecnica.

10 Modello di Adleman (1/4) - Nel suo famoso articolo del 1994 Adleman mostrò la possibilità di eseguire delle computazioni a livello molecolare; egli presentò una soluzione biologica per una istanza del problema del percorso hamiltoniano. - Un cammino hamiltoniano su un grafo orientato è un percorso che inizia da un vertice ed arriva ad un altro dopo essere passato per tutti i vertici esattamente una volta; tale cammino, se esiste, sarà formato da n-1 lati se il grafo ha n vertici - Il problema del percorso hamiltoniano per un grafo orientato (PPHO) affrontato da Adleman chiede di stabilire se in un dato grafo orientato, in cui siano stati scelti due vertici, esiste almeno un cammino hamiltoniano che li unisce. - L algoritmo è il seguente: passo 1) si generano tutti i cammini attraverso il grafo; passo 2) si considerano solo i percorsi che iniziano dal nodo di partenza e terminano nel nodo di arrivo; passo 3) si considerano solo i percorsi che attraversano esattamente n vertici; passo 4) si considerano solo i percorsi che passano per un vertice una sola volta; passo 5) si verifica se almeno un percorso è rimasto dopo le selezioni dei passi precedenti; in caso positivo quello è il cammino che si stava cercando.

11 Modello di Adleman (2/4) - Adleman utilizzava dei frammenti di DNA come oggetti di calcolo e particolari enzimi e tecniche di biologia molecolare come operatori. L implementazione di questo algoritmo si basava sull intuizione di Adleman di codificare in maniera opportuna l istanza del problema da risolvere. - Adleman codificò il grafo con le seguenti regole: ad ogni vertice i del grafo G si associa un filamento di una sequenza casuale di DNA della lunghezza di 20 nucleotidi; ogni arco i j in G viene codificato con un filamento di DNA di 20 nucleotidi ottenuto concatenando gli ultimi 10 nucleotidi del vertice i ed i primi 10 nucleotidi del vertice j. - In questo modo i filamenti potevano accoppiarsi per formare una macromolecola che codificasse un percorso attraverso il grafo: uno dei filamenti è la concatenazione delle sequenze di codifica di archi consecutivi, l altro filamento è la concatenazione delle sequenze complementari associate ai vertici del percorso considerato.

12 Modello di Adleman (3/4) -L algoritmo biologico proposto da Adleman è il seguente: passo 1) per ogni vertice e per ogni lato si codificano un numero sufficientemente grande di filamenti di DNA che si mettono in una provetta con acqua, con l enzima ligasi, sali ed altre sostanze che favoriscono l accoppiamento. In questo modo si codificano pressoché istantaneamente (quasi) tutti i possibili cammini tra i vertici. passo 2) si procede con la reazione a catena della polimerasi per amplificare solo quei filamenti di DNA che possiedono il corretto vertice di partenza e di arrivo; passo 3) con l elettroforesi su gel si separano tutte le molecole di DNA che hanno la lunghezza giusta (120 nucleotidi nell esperimento di Adleman in cui il cammino hamiltoniano era lungo 6 lati da 20 nucleotidi ciascuno). passo 4) si selezionano i percorsi che passano per tutti i vertici con la tecnica di separazione per affinità. Questa tecnica permette di estrarre tutte le sequenze che contengono la codifica di un dato vertice, sfruttando il principio di complementarietà delle basi; ripetendo questa estrazione per ogni vertice si riescono ad estrarre tutti i percorsi che passano per ogni vertice. passo 5) si verifica se almeno un filamento di DNA è rimasto dopo le selezioni dei passi precedenti procedendo prima ad amplificazione con polimerasi e poi con elettroforesi su gel che permette di individuare l eventuale filamento; se esiste, quel filamento codifica il cammino hamiltoniano che si stava cercando.

13 Modello di Adleman (4/4) - Questo esperimento non dimostrò soltanto la possibilità di ottenere una soluzione biologica al problema di ricerca del cammino hamiltoniano, ma anche e soprattutto la possibilità più generale di calcolare con il DNA. - Il numero di operazioni richieste in laboratorio cresce linearmente con il numero n di vertici del grafo, benché è noto che questo problema è NP-completo. Il numero di molecole diverse richieste per la computazione è lineare nel numero m degli archi del grafo; infatti il passo 1 richiede la sintesi artificiale di n+m sequenze di DNA, il passo 4 richiede la ripetizione della procedura per n volte e gli altri passi si svolgono in un tempo costante. - Questo significa che un computer a DNA offre una enorme capacità di calcolo parallelo che può renderlo molto più rapido di un supercomputer elettronico per la risoluzione di alcuni problemi, soprattutto all aumento del numero di variabili coinvolte. Nell esempio del PPHO il parallelismo si manifesta nella velocità con cui all inizio si codificano (quasi) tutti i possibili cammini attraverso il grafo. - Inoltre la capacità di memorizzazione del DNA è enormemente superiore rispetto a un computer tradizionale poiché un grammo di DNA, equivalente all incirca ad un centimetro cubo, può immagazzinare l informazione contenuta in circa mille miliardi di CD.

14 Modello di Lipton (1/3) - Uno scienziato di Princeton, Richard Lipton, ha inventato uno schema per tradurre le coppie di basi del DNA in sequenze di 0 e di 1. Egli è anche stato in grado di sviluppare una tecnica che consente alle molecole di DNA nella provetta di reazione di simulare il comportamento delle porte logiche di un computer elettronico. - Lipton ha così mostrato come un computer molecolare può utilizzare anch esso la logica booleana degli operatori NOT, OR, AND ed essere quindi sostanzialmente programmabile come qualsiasi altro computer general-purpose. - Lipton ha affrontato in particolare il problema della soddisfacibilità di una formula booleana (SAT-problem) che ha da subito suscitato notevole interesse nella comunità scientifica. - Nel 1995 Richard Lipton propose uno schema teorico di algoritmo per la risoluzione con il DNA del problema della soddisfacibilità per una formula booleana. Egli considerò una formula booleana nella forma normale disgiuntiva, cioè tipo FBB 1 2. Bm, in cui ogni Bi è una particolare formula booleana detta clausola; una clausola si presenta nella forma BX 1 X2. Xk, in cui ogni Xi è una delle n variabili o una delle n possibili negazioni.

15 Modello di Lipton (2/3) - L algoritmo utilizzato da Lipton per trovare la soluzione al SAT-problem è il seguente: si generano tutte le possibili combinazioni di valori per le n variabili della formula booleana; poi si eliminano tutte le assegnazioni che non soddisfano la prima clausola B1 e si ripete progressivamente la stessa operazione per tutte le assegnazioni che non soddisfano la clausola Bi, con i = 2,, m; infine si verifica se sono rimaste delle assegnazioni di valori per le variabili e, in caso positivo, quelle assegnazioni soddisfano la formula booleana. - L implementazione proposta da Lipton si basava sulla codifica di un grafo orientato con la stessa tecnica adottata da Adleman, in cui ogni nodo x i rappresenta una variabile della formula booleana ed ogni x i la sua negazione. I cammini che vanno dal nodo a 1 al nodo a n+1 si possono considerare come la codifica di un numero binario ad n cifre, in cui si può stabilire per convenzione che se dal vertice a i il cammino va verso un vertice x i allora quel tratto codifica uno 0, altrimenti se va verso un vertice x i codifica un 1.

16 Modello di Lipton (3/3) - All inizio dell esperimento si mettono in soluzione nella provetta t 0 un numero sufficientemente grande di copie di filamenti di DNA della lunghezza di 20 nucleotidi che codificano i vertici e gli archi di questo grafo così costruito. A questo si aggiungono copie di sequenze q 1 e p n, dove indichiamo con q 1 il filamento complementare degli ultimi 10 nucleotidi che codificano a 1 e con p n il filamento complementare dei primi 10 nucleotidi che codificano a n+1. Con il procedimento di accoppiamento si formeranno tutti i possibili percorsi attraverso il grafo ed inoltre la presenza dei frammenti q 1 e p n, assicureranno la formazione prevalente di cammini dal nodo a 1 al nodo a n+1 ; inoltre la simmetria del grafo implicherà che questi cammini si formeranno nella medesima quantità. Partendo dalla provetta t 0 si eliminano i frammenti di DNA che corrispondono alle assegnazioni che non soddisfano la prima clausola B 1 della formula booleana. L operazione che si effettua è l estrazione per affinità che può essere vista come una funzione E(t,i,a) che denota l insieme di tutte le sequenze contenute nella provetta t che hanno la componente i-esima uguale ad a, con a {0,1}. Quindi per passi successivi si costruiscono le provette t 1, t 2,, t m, in cui la provetta t i contiene tutte le sequenze di t i-1 che soddisfano la clausola B i. In questo modo nella provetta t m resteranno, se esistono, solo i frammenti di DNA che soddisfano tutte le clausole, ovvero l intera formula booleana F. Pertanto a questo punto basta solo verificare la presenza di DNA nella provetta per dare una risposta al problema di soddisfacibilità della formula booleana considerata.

17 Implementazione Progetto 1

18 Implementazione Progetto 2