Topi transgenici. Biologia dello sviluppo Tor Vergata Dott.ssa Merlo 30 Ott 2014

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1 Topi transgenici Biologia dello sviluppo Tor Vergata Dott.ssa Merlo 30 Ott 2014

2 CONCETTI FONDAMENTALI Cosa sono gli animali transgenici? Animali che sono stati ingegnerizzati geneticamente in modo da avere uno o più geni provenienti da una fonte esogena I transgeni sono integrati nel genoma I transgeni possono essere trasmessi attraverso la linea germinale alla progenie Il primo animale transgenico che si produce si chiama animale fondatore - founder

3 Un modo per studiare la funzione di un gene è la variazione del dosaggio genico Inserire nuove copie geniche (transgenico) Aumento della quantità di proteina DNA + wt Proteina Sostituire i geni con copie non funzionali (gene knock-out) 0 Diminuzione della quantità di proteina

4 CONCETTI FONDAMENTALI Introduzione di geni estranei in un organismo La procedura è praticamente la stessa indipendentemente dall animale coinvolto L integrazione in genere avviene prima della replicazione del DNA nell oocita fertilizzato La maggior parte degli animali transgenici ha il transgene in tutte le cellule, incluse quelle della linea germinale. La trasmissione alla generazione successiva richiede l integrazione nella linea germinale Alcune integrazioni avvengono dopo la replicazione del DNA dando luogo ad animali mosaico che potrebbero o non potrebbero contenere il transgene nella linea germinale

5 Come modificare il genoma di un mammifero in tutte le sue cellule? Scelta del tipo cellulare da utilizzare Metodi di inserzione del DNA nelle cellule Sito di inserzione del DNA nelle cellule

6 Procedura per produrre topi transgenici Sono richiesti tre diversi tipi di coppie da incrociare 1 o paio : Maschio fertile + femmina in superovulazione Maschio fertile (si cambia regolarmente) Femmina in superovulatione = femmina immatura che viene indotta a superovulare FSH nel giorno 1 Gonadotropina corionica umana (LH) nel giorno 3 Incrocio nel giorno 3 Gli oociti fertilizzati vengono microiniettati con un costrutto di DNA estraneo nel giorno 4 Gli oociti microiniettati sono trasferiti nell ovidotto di una madre surrogato alla fine del giorno 4

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8 Utilizzo di zigoti appena fecondati Metodo di inserzione del DNA: microiniezione Tutte le cellule dell organismo hanno un genoma modificato

9 Procedura per produrre topi transgenici Sono richiesti tre diversi tipi di coppie da incrociare 2 o paio : Maschio sterile + madre surrogato Maschio sterile (vasectomia) Madre surrogato = si deve accoppiare per essere un recipiente adatto alle uova iniettate Incrocio nel giorno 3 Gli oociti microiniettati provenienti dalla coppia 1 vengono trasferiti nell ovidotto della madre surrogato alla fine del giorno 4 Gli embrioni si impiantano nella parete uterina e nascono 19 giorni dopo (tecniche di Southern blotting confermano la presenza ed il numero di copie del transgene)

10 Procedura per produrre topi transgenici Sono richiesti tre diversi tipi di coppie da incrociare 3 o paio : genitori adottivi Maschio fertile + femmina incrociata in modo da avere dei cuccioli lo stesso giorno della madre surrogato I genitori adottivi possono essere utili se dovesse essere necessario un parto cesareo della madre surrogato

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12 Integrazione di un transgene nel genoma In genere il transgene si inserisce in un cromosoma dando origine ad un eterozigote - 50% di probabilità di passare il transgene alla progenie Due topi eterozigoti, incrociati possono dare origine ad un omozigote che contiene il transgene in doppia copia - 100% di probabilità di passare il transgene alla progenie Molti transgeni sono stabilmente trasmessi per molte generazioni senza riarrangiamenti

13 Meccanismi di integrazione del DNA Molecole lineari si integrano più efficientemente di molecole circolari (~5x) Una volta nell oocita, le molecole lineari circolarizzano Di solito tutte le molecole che si integrano lo fanno nello stesso cromosoma e nello stesso sito Copie multiple, in genere, si arrangiano in tandem, head-to-tail La grandezza delle molecole di DNA non è un parametro fondamentale (0.7 50Kb) La concentrazione e la purezza del DNA iniettato lo sono (massimo 1-3 mg/ml)

14 Ipotesi per l integrazione del DNA Le estremità del DNA lineare iniettato si integrano in prossimità di rotture che avvengono spontaneamente nel cromosoma Molecole iniettate che hanno circolarizzato probabilmente ricombinano fra di loro e con le copie integrate per generare tandem, head-to-tail La ricombinazione è probabilmente favorita dall alta concentrazione locale di DNA e da proprietà speciali come l assenza di una normale struttura della cromatina Il numero di rotture cromosomiche è presumibilmente limitante e spiega il basso numero di eventi di integrazione e perché diverse molecole di DNA di solito vengono integrate nello stesso sito

15 Espressione dei geni nel topo transgenico Per discriminare i prodotti del gene iniettato dalla sua controparte endogena, il gene iniettato deve essere marcato in qualche modo - mini-genes in cui gli esoni sono stati eliminati dal cdna e dove gli introni sono mancanti - Modificazioni per inserzione/delezione/mutagenesi di pochi nucleotidi (per esempio, l acquisizione o la perdita di un sito di restrizione) - geni ibridi in cui degli epitopi sono espressi insieme al prodotto transgenico

16 Espressione tessuto-specifica In genere, se un gene è tessuto-specifico, allora viene espresso in maniera appropriata, anche se si è integrato in una diversa posizione cromosomica Le proteine che agiscono in trans e promuovono l espressione tessuto-specifica possono trovare le sequenze che controllano e attivare la trascrizione a partire da varie posizioni cromosomiche I livelli di espressione cambiano nei vari animali founder dal momento che la posizione di integrazione nel genoma può influenzare l accessibilità del transgene ai fattori di trascrizione che agiscono in trans Alcuni founders non esprimono per niente il transgene dal momento che l integrazione avviene nell eterocromatina, che è silente a causa della consistente metilazione del DNA

17 Le sequenze procariotiche devono essere eliminate per una espressione ottimale Le sequenze procariotiche derivate dal plasmide o dal vettore fagico usato per replicare il transgene nei batteri possono essere inibitorie e dare fastidio all espressione del transgene Quindi, il frammento con il transgene deve essere purificato dal vettore contaminante prima della microiniezione

18 Possibili ragioni per cui il transgene non viene espresso L integrazione può avvenire in zone di silenziamento in cis (equivalenti, in negativo, agli enhancers) siti di modificazione covalente del DNA (per esempio metilazione) che potrebbero avere una condensazione da cromatina inattiva (fase dei nucleosomi) La perdita, non voluta, di alcune sequenze regolatrici durante la produzione dei costrutti (zone di binding alla topoisomerasi, siti di legame nucleo matrice) L uso del cdna invece del DNA genomico (gli introni potrebbero contribuire alla stabilità dell mrna e potrebbero anche contenere sequenze essenziali per l espressione tessuto-specifica; regioni di DNA fiancheggianti un gene potrebbero contenere sequenze regolatrici)

19 + Cosa è un topo knock out? Un topo geneticamente modificato nel quale viene soppressa l espressione di uno specifico gene endogeno (il gene è stato knocked out)

20 Mario R Capecchi, Martin J Evans e Oliver Smithies Conosciuti per la tecnica della ricombinazione omologa fra DNA transgenico e DNA genomico, un metodo utile ad alterare il genoma animale e più attendibile di quelli usati prima. Martin J Evans Capecchi ha anche fatto un analisi sitematica della famiglia murina dei geni Hox: questa famiglia genica ha un ruolo fondamentale nel controllo dello sviluppo embrionale di tutti gli organismi multicellulari Sir Martin John Evans è uno scienziato inglese che, insieme a Matthew Kaufman, pensò di usare blastocisti di topo per ottenere cellule staminali embrionali da mantenere in coltura in laboratorio (1981). Insieme a Capecchi e Oliver Smithies, altro scienziato inglese cresciuto negli US, è conosciuto per il lavoro fatto per mettere a punto il topo knockout e la tecnologia importante per il gene targeting, un metodo in cui si usano cellule staminali embrionali per creare modificazioni nei geni del topo. Oliver Smithies Nel 2007 ricevono il Premio Nobel in Medicina Mario Ramberg Capecchi

21 Perché usare un topo knock out? Si possono studiare gli effetti dei prodotti genici, le pathways biochimiche, le pathways alternative (compensatorie) e le pathways di sviluppo Si possono studiare le malattie umane in animali, stabilire modelli per testare gli effetti benefici di trattamenti medici o terapia genica

22 Come generare un topo knock out L alterazione genica nel topo KO è indirizzata a geni specifici Il DNA esogeno si deve integrare in una posizione precisa del genoma L integrazione del gene modificato avviene nelle cellule staminali embrionali ex vivo Bisogna verificare l esatto sito di integrazione prima che le ES cells vengano introdotte nella blastocisti e diventino parte dell embrione in sviluppo

23 Si utilizzano le cellule staminali embrionali (Embryonic Stem cells; ES cells) Le ES cells sono la parte della blastocisti di mammifero che darà luogo all embrione Le ES cells sono pluripotenti ovvero possono dare origine a tutti gli istotipi dell organismo

24 Cellule ES pluripotenti Le ES cells sono cellule pluripotenti, indifferenziate, derivate da cellule embrionali precoci (cellule della massa interna della blastocisti di topo) Le ES cells vengono mantenute in coltura, in vitro, sopra uno strato di fibroblasti feeder per evitare che differenzino L introduzione del transgene può avvenire per elettroporazione o infezione retrovirale Il transgene si deve integrare per ricombinazione e non in maniera casuale Le cellule trasfettate con successo possono essere identificate prima dell iniezione nella blastocisti accettrice

25 Gene targeting nelle ES cells Il gene targeting si ottiene usando dei costrutti disegnati per la ricombinazione omologa. Questa tecnica può essere usata per - Il Knockout funzionale dei geni per studiare il loro contributo ai diversi stadi embrionali o processi patologici (mutazioni null) - Rimpiazzare un gene mutato/non funzionante con un gene funzionante per ripristinare il fenotipo wild type

26 Le ES cells possono essere modificate (inserendo DNA nel loro genoma) rimanendo pluripotenti -Trasfezione - Elettroporazione

27 La trasfezione Diversi tipi di sostanze chimiche sono in grado di legarsi al Dna e ne mediano l ingresso nella cellula Il DNA entra nella cellula mediante sostanze chimiche che alterano la permeabilità della membrana

28 L elettroporazione Il DNA entra nella cellula mediante una scarica elettrica controllata che altera la permeabilità della membrana

29 Costrutti di DNA per la ricombinazione I vettori di DNA usati per generare KO hanno il gene di interesse interrotto dal gene per la resistenza ad un antibiotico (igromicina o G418/geneticina) Per ottenere l integrazione indirizzata avvenga le regioni che fiancheggiano il DNA contengono il gene per la timidina chinasi (TK) come marker. Se la TK si integra (integrazione casuale), allora le cellule trasfettate muoiono quando vengono mantenute in un terreno selettivo (gancyclovir)

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31 Selezione delle ES cells Le ES cells resistenti al Gancyclovir e a G418 crescono in piccoli grumi sopra delle cellule feeder Le colonie possono essere picked e trasferite in nuove piastre che contengono cellule feeder Quando si ha il numero sufficiente di cellule: - Si congelano per sicurezza - Si analizzano per Southern blotting o PCR per determinare la natura dell evento di integrazione Si microiniettano nel blastocele, la cavità della blastocisti

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33 Le ES cells modificate possono essere reinserite nella blastocisti tramite microiniezione

34 E dunque necessario selezionare la progenie per otterere topi con un genotipo omogeneo eterozigote o omozigote Il topo chimerico (P1) è eterozigote per la mutazione o non la porta Conseguentemente, qualora la chimera sia eterozigote, in P2 ci saranno eterozigoti o wt In P3 l assortimento genotipico segue le regole mendeliane per l incrocio tra due eterozigoti

35 Dove si deve inserire il DNA nella cellula? - Nei transgenici il DNA può inserirsi casualmente nel genoma ospite (a patto che non modifichi altri geni o sia silenziato) - Nel gene Knock-out il DNA deve ricombinare esattamente con la copia del medesimo gene del genoma ospite

36 Metodi per inserire un transgene

37 Differenza fondamentale tra l uso delle ES cells e delle cellule della linea germinale Chimera L animale generato possiede solo in alcuni tessuti il transgene o la copia non funzionale del gene (quelli derivati dalle ES cells modificate e reinserite); viene pertanto detto chimera. Solo le chimere che avranno incorporato la copia genica nella linea germinale potranno passarla alle generazioni future

38 Esempi di animali Knock-out: Il topo Knock-out di p53

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