Diffrazione di Raggi-X da Monocristalli A.A Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano
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1 Diffrazione di Raggi-X da Monocristalli A.A Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano
2 Raccolta Dati di Diffrazione: Diffrazione di Raggi X
3 Raccolta Dati di Diffrazione: raggi X 2θ I hkl cristallo detector h = 2, k = 1, l = 0 h = 1, k = 3, l = 0 Il fenomeno fisico della diffrazione da parte di un cristallo può essere visto come un fenomeno di riflessione della radiazione X da parte dei piani del reticolo cristallino definiti dagli indici di Miller (h,k,l). La diffrazione di raggi X nel cristallo avviene in direzioni discrete e le condizioni geometriche che definiscono la diffrazione possono essere descritte mediante la legge di Bragg.
4 Legge di Bragg: θ θ 2d hkl sinθ = nλ d hkl = distanza interplanare della famiglia di piani reticolari definiti dagli indici di Miller (h,k,l) λ = lunghezza d onda radiazione incidente θ = angolo di riflessione
5 Legge di Bragg: θ θ Per avere un effetto di diffrazione (interferenza positiva tra le onde elettromagnetiche riflesse dai vari piani reticolari definiti da hkl, per qualunque valore di hkl) occorre che la differenza di cammino ottico (Δ) fra le varie onde riflesse sia un multiplo intero della lunghezza d onda λ. Δ = AB + BC = d senθ + d senθ = 2d senθ Δ = nλ (n intero) 2d senθ = nλ
6 Intensità di Diffrazione e Fattori di Struttura: Risultato dell esperimento di diffrazione h k l I σ eccetera...
7 Intensità di Diffrazione e Fattori di Struttura: I hkl = k λ 3 F hkl 2 V cryst /V 2 cell k = coeff. di proporzionalità V cryst = volume del cristallo V cell = volume della cella elementare Il fattore di struttura F hkl è un vettore che rappresenta in modulo (F hkl ) e fase (φ hkl ) l onda riflessa dalla famiglia di piani reticolari hkl, quando per essi è verificata la legge di Bragg. F hkl può essere espresso come somma degli N contributi dei singoli atomi j- esimi presenti nella cella cristallina.
8 Fattori di Scattering atomico: Ad ogni onda diffratta contribuiscono tutti gli atomi della cella elementare. Ogni atomo diffrange in base agli elettroni che possiede. Un atomo con pochi elettroni (e - ) è considerato un diffusore scadente di raggi X. Il potere di diffrazione di un atomo è detto fattore di scattering f (espresso in elettroni). f = ampiezza dell onda diffratta dall atomo ampiezza dell onda diffratta da un e -
9 Fattori di Scattering atomico: Esempio: Atomo di Carbonio f (espresso in elettroni) B = 0 B = 20 B = 10 all aumentare di θ, f diminuisce (senθ)/λ senθ/λ=0 f = numero atomico (tutti gli e - diffrangono in fase)
10 Fattori di Scattering atomico: La radiazione emessa dagli elettroni di un atomo nella stessa direzione del fascio incidente è quella più intensa, perché corrisponde ad una differenza di fase nulla tra le onde diffuse da punti diversi della densità elettronica. All aumentare di θ l ampiezza della radiazione diffusa decresce, perché i contributi di porzioni diverse della nuvola elettronica tendono ad elidersi reciprocamente. densità elettronica radiazione diffratta radiazione incidente Δx atomo θ
11 Fattori di Scattering atomico: Le oscillazioni dell atomo attorno alla sua posizione di equilibrio (dipendenti dalla temperatura) si traducono in una espansione della distribuzione elettronica mediata nel tempo. La diffrazione dovuta ad un atomo j-esimo risulta allora smorzata dal fattore di temperatura B j (o di Debye-Waller), con un effetto più marcato a grandi angoli: f f j (θ, B) = f 0 j exp [-B j (sen2 θ)/λ 2 ] con B j = 8π 2 <μ j2 >, dove <μ j2 > indica lo scostamento quadratico medio associato alle vibrazioni atomiche attorno alla posizione di equilibrio per l atomo j-esimo. (senθ)/λ
12 Serie di Fourier: Onda monodimensionale: Un onda può essere descritta come una funzione periodica che può essere espressa come una somma di funzioni sinusoidali del tipo: F = ampiezza dell onda h = frequenza dell onda α = fase dell onda a(x) = F cos 2π (hx + α) b(x) = F sen 2π (hx + α)
13 Serie di Fourier: Nel caso si utilizzi come funzione base la funzione coseno, una qualunque funzione periodica monodimensionale f(x) potrà essere approssimata dalla somma (detta Serie di Fourier): f(x) = F 0 cos 2π (0x + α 0 ) + F 1 cos 2π (1x + α 1 ) + + F 2 cos 2π (2x + α 2 ) + + F n cos 2π (nx + α n ) cioè: f(x) = Σ F h cos 2π (hx+ α h ) n h = 0 F = ampiezza, h = frequenza, α = fase
14 Serie di Fourier: n f(x) = Σ F h cos 2π (hx+ α h ) h = 0 f(x) = cos 2π (x) F = 1, h = 1, α = 0 f(x) = 3 cos 2π (x) F = 3, h = 1, α = 0 f(x) = cos 2π (5x) F = 1, h = 5, α = 0 f(x) = cos 2π (x + 1/4) F = 1, h = 1, α = 1/4
15 Serie di Fourier: f 0 (x) = 1 f 1 (x) = cos 2π (x) f 2 (x) = (- 1/3) cos 2π (3x) f 3 (x) = (1/5) cos 2π (5x)
16 Serie di Fourier: Una utile onda base per approssimare un onda periodica è data da c(x) = F cos 2π (hx + α) + i F sen 2π (hx + α) = = F [cos 2π (hx + α) + i sen 2π (hx + α)] = (*) = F [e 2πi(hx + α) ] = ( F e 2πi α ) e 2πi(hx) = C e 2πi(hx) dove C = F e 2πi α (*) poiché (cos θ + i sen θ) = e iθ Allora, data una generica onda periodica f(x) può essere scritta come: n f(x) = Σ C h e 2πi(hx) = Σ C h e 2πi(hx) h = 0 h
17 Serie di Fourier: Onda monodimensionale: n f(x) = Σ C h e 2πi(hx) = Σ C h e 2πi(hx) h = 0 h Onda tridimensionale: f(x,y,z) = ΣΣΣC hkl e2πi(hx+ ky+ lz) h k l
18 Rappresentazione vettoriale di numeri complessi: Un qualunque numero complesso F = A + ib, dove i = (-1) 1/2 può essere rappresentato come un vettore nel piano complesso asse immaginario asse immaginario A F B asse reale F α F cos α F sen α asse reale F = F = F (cos α + i sen α) = F e iα = F e iα
19 Fattori di Struttura: Ad ogni effetto di diffrazione ( riflesso = annerimento puntiforme sul detector) è associata un onda di intensità I hkl I hkl = k λ 3 F hkl 2 V cryst /V 2 cell Il fattore di struttura F hkl ( F hkl ) descrive un onda (raggio X) diffratta che produce un riflesso sul rivelatore. Da un punto di vista matematico, come qualunque altra onda tridimensionale (funzione periodica), il fattore di struttura può essere espresso sotto forma di Serie di Fourier del tipo: N F hkl = Σ f j e [2πi(hxj + kyj + lzj)] = F hkl e iα hkl j=1
20 Fattori di Struttura: N F hkl = Σ f j e [2πi(hxj + kyj + lzj)] = F hkl e iα hkl j=1 N = numero di atomi presenti nell unità di cella f j = fattore di scattering atomico per ciascun atomo j-esimo (x j,y j,z j ) = posizione nell unità di cella di ciascun atomo j-esimo Ciascuna raggio diffratto (identificato da hkl) è un onda data dalla somma dei contributi diffrattivi di tutti gli atomi (N) presenti nell unità di cella. Quindi, il fattore di struttura che descrive il riflesso hkl è una serie di Fourier in cui ciascun termine è il contributo di ciascun atomo, trattato come una semplice sfera di densità elettronica. Il contributo di ciascun atomo j a F hkl dipende: (1) dal tipo di atomo, cosa che determina f j cioè l ampiezza del contributo (2) dalla posizione dell atomo (x j,y j,z j ) nella cella elementare, che determina la fase del contributo.
21 Fattori di Struttura: i Esempio (N = 4 atomi) f 4 F hkl f 3 α 3 α 4 α f 2 1 α hkl α 1 F hkl = f 1 + f 2 + f 3 + f 4 = f 1 e iα 1 + f2 e iα 2 + f3 e iα 3 + f4 e iα 4 = Σ fj e iα j = Fhkl e iα hkl f 2 4 j = 1 r con N = numero atomi nella cella elementare (= 4 in questo caso) h, k, l = indici di Miller x j, y j, z j = coordinate dell atomo j-esimo nella cella elementare
22 Densità Elettronica: Da un punto di vista matematico, il fattore di struttura F hkl (per ogni terna hkl) può essere definito come la trasformata di Fourier della densità elettronica ρ(xyz). Tale densità elettronica, che esprime la posizione degli atomi (cioè la struttura tridimensionale) della proteina nella cella elementare, può dunque essere determinata come trasformata di Fourier inversa di F hkl : 1 V + ρ(x,y,z) = ΣΣΣ F hkl e -2πi(hx+ky+lz) = Σ (F hkl e i α hkl ) e -2πi(hx+ky+lz) h=- k l 1 V hkl
23 Problema della Fase: 1 V + ρ(x,y,z) = ΣΣΣ F hkl e -2πi(hx+ky+lz) = Σ (F hkl e i α hkl ) e -2πi(hx+ky+lz) h=- k l 1 V hkl Da un semplice esperimento di diffrazione di raggi X su un monocristallo macromolecolare nativi si misurano i moduli di F hkl (F hkl ) mentre non si hanno informazioni sulle fasi α hkl. Quindi non è possibile calcolare la funzione densità elettronica per gli atomi che si trovano nella cella elementare. Per ottenere informazioni su e quindi essere in grado di calcolare la funzione densità elettronica è necessario utilizzare i seguenti metodi: - metodo delle Sostituzioni Molecolari ( Molecular Replacement ) - metodo delle Sostituzioni Isomorfe o metodo degli Atomi Pesanti
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