CORSO di DIDATTICA LIBERA METODICHE SPETTROFOTOMETRICHE E LORO APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE

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1 CORSO di DIDATTICA LIBERA METODICHE SPETTROFOTOMETRICHE E LORO APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE Anna Cozzoli Sezione di Farmacologia Facoltà di Farmacia Bari, 11 Dicembre 2012

2 APPLICAZIONI DELLE METODICHE SPETTROFOTOMETRICHE IN FARMACOLOGIA O Neill et al., AMPK regulation of fatty acid metabolism and mitochondrial biogenesis: Implications for obesity. Molecular and Cellular Endocrinology.

3 APPLICAZIONI DELLE METODICHE SPETTROFOTOMETRICHE IN FARMACOLOGIA Molecole coinvolte nella trasmissione del segnale SPETTROFOTOMETRIA Recettori Metaboliti Secondi Messaggeri

4 APPLICAZIONI DELLE METODICHE SPETTROFOTOMETRICHE IN FARMACOLOGIA Molecole coinvolte nella trasmissione del segnale SPETTROFOTOMETRIA Recettori Metaboliti Kits commerciali Secondi Messaggeri

5 TEMATICHE della LEZIONE: Principi generali della spettrofotometria L analisi quantitativa Dosaggio enzimatico e dosaggio delle proteine totali Esempi applicativi ELISA (Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima) Esempi applicativi

6 SPETTROFOTOMETRIA E una tecnica analitica che permette la determinazione qualitativa e quantitativa di una sostanza, mediante lo sviluppo della sua interazione con una radiazione elettromagnetica di opportuna frequenza Lunghezza d onda λ nm Frequenza ν Hertz Velocità di propagazione c km/sec nel vuoto

7 SPETTROSCOPIA LA RADIAZIONE CON PIU ALTA ENERGIA E QUELLA CON PIU BASSA LUNGHEZZA D ONDA

8 SPETTROSCOPIA Le radiazioni elettromagnetiche possono essere classificate in base al valore di λ la distanza lineare fra due punti equidistanti su onde successive, ovvero la distanza reciproca tra due massimi o due minimi

9 SPETTROSCOPIA Le radiazioni elettromagnetiche possono essere classificate in base al valore di λ la distanza lineare fra due punti equidistanti su onde successive, ovvero la distanza reciproca tra due massimi o due minimi L insieme delle radiazioni (onde) elettromagnetiche costituisce lo spettro elettromagnetico La luce è un particolare tipo di onda elettromagnetica che si crea per rapidissima oscillazione di cariche elettriche

10 METODI SPETTROSCOPICI: il principio ASSORBIMENTO: Diminuzione di intensità (attenuazione) della radiazione elettromagnetica in seguito ad interazione con l analita EMISSIONE: La radiazione emessa quando un analita viene eccitato con energia termica, elettrica o radiante Ogni sostanza assorbe o emette radiazioni di lunghezza d'onda ben determinata: l'analisi dello spettro permette di individuare la natura della sostanza in esame la misura dell'intensità delle radiazioni emesse o assorbite permette di risalire alla quantità di sostanza analizzata

11 L ANALISI SPETTROFOTOMETRICA L assorbimento della radiazione luminosa da parte di una sostanza trova applicazione pratica nella SPETTROFOTOMETRIA E una tecnica analitica che permette di effettuare determinazioni QUANTITATIVE QUALITATIVE di una sostanza in soluzione, mediante lo studio della sua interazione con la radiazione elettromagnetica

12 CONCETTI FONDAMENTALI: 1. Ogni tipo di radiazione elettromagnetica si può rappresentare sia come onda avente una certa frequenza sia come particella con un energia correlata alla frequenza 2. Le molecole interagiscono con una radiazione elettromagnetica assorbendo o cedendo energia, passando cioè da stati ad energia minore a stati ad energia maggiore (assorbimento) o da stati ad energia maggiore a stati ad energia minore (emissione) 3. Dall energia assorbita od emessa sotto forma di radiazione si possono ricavare informazioni strutturali e/o analitiche.

13 L APPLICAZIONI della SPETTROFOTOMETRIA Analisi quantitativa diretta: per sostanze che assorbono ad una data lunghezza d onda e.s. le proteine il cui assorbimento a 280 nm si basa principalmente sul contenuto di aa aromatici Analisi quantitativa indiretta: tramite una reazione colorimetrica; molte sostanze possono reagire con altre e dare un prodotto colorato Attività enzimatica: si misura la velocità di comparsa o scomparsa di una sostanza con un picco caratteristico di assorbimento, che partecipa come substrato o come prodotto alla reazione enzimatica in esame Analisi qualitativa: spettro d assorbimento

14 L APPLICAZIONI della SPETTROFOTOMETRIA Analisi quantitativa diretta: per sostanze che assorbono ad una data lunghezza d onda e.s. le proteine il cui assorbimento a 280 nm si basa principalmente sul contenuto di aa aromatici Analisi quantitativa indiretta: tramite una reazione colorimetrica; molte sostanze possono reagire con altre e dare un prodotto colorato Attività enzimatica: si misura la velocità di comparsa o scomparsa di una sostanza con un picco caratteristico di assorbimento, che partecipa come substrato o come prodotto alla reazione enzimatica in esame Analisi qualitativa: spettro d assorbimento

15 ANALISI QUANTITATIVA Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una radiazione attraversa una soluzione, viene assorbita più o meno intensamente a seconda della concentrazione L'ASSORBIMENTO DIPENDE DALLA CONCENTRAZIONE I 0 = l intensità della radiazione incidente I= l intensità della radiazione trasmessa

16 ANALISI QUANTITATIVA A (Assorbanza) o Densità ottica (O.D.) = log I 0 /I A = ε C l Legge di Lambert-Beer C= concentrazione della soluzione o specie chimica in esame (moli/litro) l= cammino ottico (ovvero lo spessore della soluzione) ε = coefficiente di estinzione molare (ovvero l assorbimento che subisce un raggio di luce monocromatica nell attraversare una soluzione a concentrazione unitaria e cammino ottico di 1 cm)

17 ANALISI QUANTITATIVA La legge di Lambert-Beer descrive i fenomeni di assorbimento di radiazioni elettromagnetiche ed è valida per radiazioni monocromatiche e soluzioni diluite. LA PROPORZIONALITA' DIRETTA TRA ASSORBANZA E CONCENTRAZIONE PERMETTE DI EFFETTUARE ANALISI QUANTITATIVE Determinare la concentrazione di una proteina sapendo che: A 280 nm = 0, 80 l= 1, 0 cm ε= M -1 cm -1 L'equazione A = ε x l x C rappresenta una retta passante per l'origine degli assi e in cui ε x l è il coefficiente angolare

18 ANALISI QUANTITATIVA La legge di Lambert-Beer descrive i fenomeni di assorbimento di radiazioni elettromagnetiche ed è valida per radiazioni monocromatiche e soluzioni diluite. LA PROPORZIONALITA' DIRETTA TRA ASSORBANZA E CONCENTRAZIONE PERMETTE DI EFFETTUARE ANALISI QUANTITATIVE Determinare la concentrazione di una proteina sapendo che: A 280 nm = 0, 80 l= 1, 0 cm ε= M -1 cm -1 A = ε x l x C 0,80 = M -1 cm -1 x 1,0 cm x C c (mol/l)= 0,80 / (12500 M-1) = 6,4 x 10-5 M L'equazione A = ε x l x C rappresenta una retta passante per l'origine degli assi e in cui ε x l è il coefficiente angolare

19 LO SPETTROFOTOMETRO Lo spettrofotometro è paragonabile ad un sistema che riceve in ingresso l analita e che produce in uscita un segnale elettrico che codifica l informazione desiderata In un analisi spettrofotometrica il campione è confrontato con la soluzione del bianco SORGENTE LUMINOSA (tungsteno per il visibile, deuterio per UV) DISPOSITIVO MONOCROMATORE CONTENITORE DEL CAMPIONE RIVELATORE FOTOMOLTIPLICATORE (che trasforma il segnale luminoso in impulso elettrico)

20 LO SPETTROFOTOMETRO I CONTENITORI DEL CAMPIONE Cuvette o cellette Sono a forma di parallelepipedo, con due facce piane, parallele ed omogenee che sono quelle che dovranno essere attraversate dal raggio monocromatico ed altre due zigrinate per facilitarne la presa e distinguerle dalle altre due Spessori tra 0,2 e 1 cm Devono offrire una trasparenza totale alle radazioni monocromatiche L efficienza di una cuvette dipende dal modo in cui viene conservata e usata Impronte digitali, grasso o altri depositi alterano marcatamente le caratteristiche di trasmissione

21 DOSAGGIO ENZIMATICO SCOPO: DOSARE LA QUANTITÀ DI UN SUBSTRATO CHE PRENDE PARTE ALLA REAZIONE CATALIZZATA DA UN ENZIMA DOSARE L ATTIVITÀ DI UN ENZIMA, CIOÈ LA VELOCITÀ DI REAZIONE CATALIZZATA DA UN ENZIMA Strumento diagnostico per il danno di un tessuto e/o organo Carenze e/o difetti enzimatici sono responsabili di sindromi biochimiche (Ultrospec 2100 pro-amersham Biosciences)

22 DOSAGGIO ENZIMATICO: lattato deidrogenasi NADH (assorbe a 340 nm) NAD+ (non assorbe a 340 nm) Diminuzione di assorbanza a 340 nm dovuta all ossidazione dell NADH a NAD+

23 DOSAGGIO ENZIMATICO: lattato deidrogenasi PROCEDURA: 1. Reagente 1 (sodio piruvato) + Campione (PLASMA) 2. Mescolare e incubare per 1 minuto 3. Reagente 2 (NADH 2 ) 4. Mescolare e leggere l assorbanza dopo 1 min (A0) 5. Ripetere la lettura di assorbanza dopo 1 (A1), 2 (A2), 3 min (A3) 6. Calcolare la ΔA =(A1-A0)+(A2-A0)+ (A3-A0)/3 7. ΔA/min X F = attività di LDH in (U/L) 8. F = 8888 a 340nm

24 nei laboratori di farmacologia la lattato deidrogenasi

25 DOSAGGIO ENZIMATICO: creatina chinasi Determinazione spettrofotometrica a 340nm l assorbanza dovuta a NADPH è proporzionale all attività dell enzima

26 nei laboratori di farmacologia la creatina chinasi

27 DOSAGGIO DELLE PROTEINE CON IL METODO DI BRADFORD (BLUE COMASSIE) E basato sul legame del colorante Coomassie blue alle proteine A ph acido il colorante libero ha due picchi di assorbimento nel visibile, a 470 e a 650 nm; quando si lega ad una proteina ha un picco massimo di assorbimento a 595 nm Sensibilità fino a concentrazioni di 20 g/ml Sviluppo del colore immediato e stabilità del complesso Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l assorbanza a 595 nm La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione, pertanto l intensità del colore blu (e dunque l assorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di colorante il saggio è indipendente dal tipo di proteina

28 DOSAGGIO DELLE PROTEINE CON IL METODO DI BRADFORD Accendere e tariamo lo spettrofotometro 15 min prima dell uso Diluire i campioni con tampone a una concentrazione di 1-20 microgrammi/µl Preparare gli standards contenenti 1-20 microgrammi proteina (albumina) in un volume di 1000 µl Aggiungere 200 µl di reagente Bradford e complementare a 1000 µl con acqua; mescolare e incubare 5-10 minuti a temperatura ambiente Misurare l assorbimento a 595 nm X mg/ml Poiché l intensità della colorazione non è lineare in una vasta gamma di concentrazioni di proteine, si raccomanda fortemente di preparare una curva standard per ogni saggio. 1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml 8 mg/ml 16 mg/ml

29 Intensità del colore blu Assorbanza a 595 nm DOSAGGIO DELLE PROTEINE CON IL METODO DI BRADFORD CURVA STANDARD E DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DELLA PROTEINA DI INTERESSE g di proteina

30 METODICHE SPETTROFOTOMETRICHE SU MULTIPIASTRA kits commerciali Victor V (PerkinElmer) Piastra multi-pozzetto Allestimento della piastra

31 VICTOR V3 (PerkinElmer) Metodi applicabili: Assorbanza in UV Luminometria Fluorimetria Fluorimetria a tempo risolto (DELFIA e LANCE) Fotometria

32 ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Combina la specificità degli anticorpi con la sensibilità dei dosaggi enzimatici Principio: sfrutta la capacità delle superfici di plastica di adsorbire quantità piccole ma rivelabili di proteina Si tratta di un saggio in fase solida effettuato su piastre da micro-dosaggio. Ogni piastra contiene 96 pozzetti e permette di saggiare contemporaneamente un elevato numero di campioni. Fornisce informazioni solo sulla presenza/concentrazione di una molecola, non sulle sue proprietà biochimiche (es. peso molecolare, localizzazione cellulare, etc)

33 ELISA TIPOLOGIE 1. DIRETTO O SANDWICH (misura l antigene): l antigene viene direttamente adeso alla base solida (pozzetto), seguito da un anticorpo direttamente marcato con un enzima HRP HRP Ag Ag 2. INDIRETTO (misura l anticorpo) l antigene anche in questo caso viene direttamente adeso alla base solida ma in questo caso l anticorpo primario non sarà direttamente marcato, ma un anticorpo secondario marcato, specifico contro quello primario, verrà aggiunto HRP HRP Ag Ag

34 ELISA Diretto o Sandwich Indiretto

35 ELISA Per saperne di più

36 ELISA DILUIZIONI SERIALI E CURVA STANDARD Obiettivo: determinare la concentrazione di una molecola Preparazione della curva standard che contiene concentrazioni note della molecola Le diluizioni vengono tipicamente effettuate in n-fold serial manner: es 10-fold:

37 O.D ELISA DILUIZIONI SERIALI E CURVA STANDARD [ ] del campione

38 nei laboratori di farmacologia ELISA VALUTAZIONE LIVELLI CITOCHINA PRO-INFIAMMATORIA-TGF-β

39 nei laboratori di farmacologia SPETTROFOTOMETRIA SU LINEA CELLULARE Determinazione proliferazione cellulare Determinazione citotossicità da H 2 O 2 Determinazione dell effetto protettivo di farmaci antiossidanti sulla citotossicità da H 2 O 2 LINEA CELLULARE DI MIOBLASTI MURINI (C 2 C 12 ) Cell Counting Kit, CCK-8 Alexis Biochemicals

40 nei laboratori di farmacologia VALUTAZIONE DELLA CRESCITA CELLULARE CORRELAZIONE LINEARE TRA CONCENTRAZIONE CELLULARE E VALORI DI ASSORBANZA CRESCITA TEMPO-DIPENDENTE DELLE CELLULE C 2 C 12 IN FUNZIONE DELLA CONCENTRAZIONE CELLULARE

41 nei laboratori di farmacologia VALUTAZIONE DELL EFFETTO CITO-TOSSICO DELL H 2 O 2 EC 50 = 650 μm L ESPOSIZIONE AD H 2 O 2 PER SEI ORE DETERMINA UNA DIMINUZIONE DEL NUMERO DELLE CELLULE IN MANIERA CONCENTRAZIONE-DIPENDENTE *Significativamente differente rispetto alla 10μM; 0.005<p<0.05 ( t di student-test) Significativamente differente rispetto alla 300μM; p<0.05 ( t di student-test)

42 nei laboratori di farmacologia VALUTAZIONE DELL EFFETTO CITO-PROTETTIVO DEL N-ACETILCISTEINA (NAC) NAC PRE-INCUBATO DUE ORE PRIMA DELL H2O2 *Statisticamente significativo rispetto alla H 2 O μm, p<0.005 (t-student test) Statisticamente significativo rispetto alla H 2 O μm, p<0.001 (t-student test) Statisticamente significativo rispetto alla H 2 O 2 1 mm, p<0.001 (t-student test)

43 APPLICAZIONI ATTUALI DELLE METODICHE SPETTROFOTOMETRICHE NEI NOSTRI LABORATORI Dosaggi di enzimi plasmatici SPETTROFOTOMETRIA Determinazione livelli citochine su estratti tissutali Determinazione proliferazione cellulare, effetto citotossico e protettivo di farmaci

44 Grazie a tutti per l attenzione Vi aspettiamo in laboratorio

A = εlc c = A/εl c = 0.2/38000 M -1 cm -1 1 cm c = M = 5 μm

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