la purificazione può essere di tipo analitico o preparativo Purificare una proteina significa ottenerla in forma omogenea

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1 la purificazione può essere di tipo analitico o preparativo Purificare una proteina significa ottenerla in forma omogenea Analisi delle sue proprietà fisiche e biologiche Come viene modulata la sua espressione in seguito al trattamento con

2 Le proprietà delle proteine che vengono sfruttate per ottenere lo scopo sono: La dimensione e forma il contenuto in aminoacidi acidi o basici: la carica di una proteina è la somma delle cariche (+) e (-) ad un determinato ph) il punto isoelettrico solubilità densità idrofobicità capacità a legare metalli o altre molecole specificità di sequenza o di struttura (anticorpi) presenza di modifiche post-traduzionali proprietà caratteristica (es. termolabilità)

3 OBIETTIVO: purificare una proteina I FASE: RICERCA BIBLIOGRAFICA DOMANDE: 1. Quali informazioni abbiamo? 2. Quali sono le caratteristiche della proteina? 3. Quali funzioni svolge nella cellula? 4. Dove è presente in elevate quantità? 5. Quali difficoltà ci aspettiamo di incontrare? II FASE: scelta della procedura DOMANDE: 1. Qualità o quantità? 2. Identificazione della fonte 3. Scelta dei passaggi FASE OPERATIVA Scelta del sistema biologico Tappe per il suo isolamento e purificazione Caratterizzazione GRADO DI PUREZZA Piccole quantità di contaminanti possono essere tollerate, dipende dalle indagini da effettuare Grado di purezza del 70% è sufficiente per la maggior parte delle analisi sperimentali Analisi cristallografica richiede campioni proteici puri

4 Fasi di una purificazione 1) sviluppo di un metodo di saggio adeguato 2) selezione del sistema biologico 3) Solubilizzazione della proteina 4) sviluppo dei passaggi di purificazione 5) concentrazione, conservazione

5 1) sviluppo di un metodo di saggio adeguato specifico sensibile poco costoso rapido saggio funzionale SDS-PAGE saggio immunologico marcatura (fluorescente o radioattiva)

6 2) selezione del migliore sistema biologico dove la proteina è maggiormente espressa Sistema dove la proteina può essere iperespressa

7 3) solubilizzazione della proteina e sviluppo dei passaggi di purificazione TEMPO, TEMPERATURA, ANTI-PROTEASI proteine proteine proteine intracellulari extracellulari di membrana disintegrazione separazione cellulare dalle cellule disintegrazione cellulare separazione da materiale insolubile (chiarificazione dell estratto)

8 Disintegrazione cellulare Metodi per rompere le cellule -metodi blandi lisi per osmosi digestione enzimatica solubilizzazione chimica omogenizzatori -metodi moderati omogenizzatori a lama mortaio -metodi vigorosi French press Sonicazione Macinazione con microsfere Na +, Ca 2+ K + Mg 2+ Coltura cellulare o tessuto Lisi per osmosi Shock osmotico

9 Digestione enzimatica Lisi della parete+ shock osmotico Solubilizzazione chimica O SO - 3 Na + Sodio dodecil solfato Omogeneizzazione con potter

10 Metodiche di omogenizzazione e lisi cellulare Potter, frullatori, French-press Metodiche per la separazione di organelli subcellulari (nuclei, mitocondri,ribosomi) Centrifugazione differenziale CONDIZIONI bassa temperatura uso di soluzioni tampone sterilità; uso di inibitori di proteasi

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12 3) solubilizzazione della proteina e sviluppo dei passaggi di purificazione TEMPO, TEMPERATURA, ANTI-PROTEASI solubilita differenziale proteine proteine proteine intracellulari extracellulari di membrana disintegrazione separazione cellulare dalle cellule disintegrazione cellulare separazione da materiale insolubile (chiarificazione dell estratto)

13 Metodi di frazionamento - Le proteine vengono purificate tramite procedimenti di frazionamento. vengono sfruttate le proprietà chimico-fisiche della proteina di interesse a) la solubilità; b) la carica ionica; c) la massa molecolare d) l affinità di legame ad altre molecole e).

14 Perche in presenza di sali o metanolo le proteine precipitano? Le proteine differiscono nel numero di gruppi polari esposti al solvente La loro solubilita sara diversa in presenza di concentrazioni diverse di sali o solventi organici

15 Solubilità di una proteina dipende: Dalla concentrazione dei Sali disciolti Dalla polarità del solvente Dal ph Dalla temperatura SEPARAZIONE SELETTIVA DI PROTEINE CON I SALI SALTING IN a bassa concentrazione ionica l aggiunta l di un sale: Maschera i gruppi carichi della proteina Diminuisce le forze di attrazione tra le molecole LA SOLUBILITA DI UNA PROTEINA AUMENTA

16 + H + H O- Na + Cl - + H + H O- Na + Cl - + H + H O- I gruppi idrofobici sono rivolti verso l interno I gruppi idrofilici sono rivolti verso l esterno. + H Na + Cl - + H O- Na + Cl - al crescere della concentrazione salina i gruppi idrofobici delle proteine vengono scoperti

17 Questi frammenti idrofobici esposti causano l aggregazione delle proteine (interazioni idrofobiche) e la precipitazione salting out Precipitazione delle proteine meno solubili Precipitazione della proteina d interesse Precipitazione delle proteine più solubili 1.00 Frazione solubile [(NH 4 ) 2 SO 4 ] (M) Schema di precipitazione in presenza di Ammonio solfato Più la proteina contiene tratti idrofobici e piu risultera insolubile a basse concentrazioni saline (e viceversa)

18 Solubilita differenziale - salting out La solubilità di una proteina diminuisce quindi precipita (NH 4 ) 2 SO 4 influenza la sfera di idratazione delle proteine Favorisce le interazioni Idrofobiche tra le molecole e causa la loro precipitazione

19 PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI In una soluzione acquosa contenente solventi organici (metanolo, etanolo, butanolo, acetone) le molecole di acqua si dispongono a idratare le molecole di solvente organico. L acqua di solvatazione viene quindi rimossa dai gruppi carichi e polari sulla superficie delle proteine. I gruppi carichi delle proteine vengono scoperti e le proteine si aggregano per la formazione di: interazioni ioniche precipitano in ordine decrescente a seconda del numero di gruppi carichi presenti sulla loro superficie e in misura maggiore man mano che aumenta la concentrazione del solvente

20 4) Sviluppo dei passaggi di purificazione TEMPO, TEMPERATURA, ANTI-PROTEASI solubilita differenziale proteine proteine proteine intracellulari extracellulari di membrana disintegrazione separazione cellulare dalle cellule disintegrazione cellulare separazione da materiale insolubile (chiarificazione dell estratto) isolamento della isolamento frazione cellulare della frazione di membrana, solubilizzazione

21 Centrifugazione differenziale Fc = mω 2 r

22 Frazione

23 La velocità di sedimentazione di una particella può essere espressa in termini di coefficiente di sedimentazione (s) che corrisponde alla velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato Il coefficiente di sedimentazione ha le dimensioni di un tempo e si misura in Svedberg, S. 1 S = sec Esempio: s = 5 x sec corrisponde a 5S Specie sedimentate Enzimi, ormoni e proteine Acidi nucleici Ribosomi, polisomi Virus Lisosomi Membrane Mitocondri Coeff. di sedimentazione 2 25S 3 100S S S 4000S S S

24 Centrifugazione - coefficiente di sedimentazione e densita 150,000g /40min 10,000g /20min 1,000g /2min

25 Consente di separare una o più molecole disciolte in una soluzione sulla base delle loro dimensioni. membrana semipermeabile che permette il passaggio selettivo di molecole. Il movimento delle molecole si realizza a partire da una differenza di concentrazione (gradiente) di ciascuna di esse tra i soluti presenti nei due compartimenti, quello all interno del tubo e quello all esterno. La diffusione si arresta al raggiungimento dell equilibrio

26 4) Sviluppo dei passaggi di purificazione TEMPO, TEMPERATURA, ANTI-PROTEASI solubilita differenziale proteine proteine proteine intracellulari extracellulari di membrana disintegrazione separazione cellulare dalle cellule disintegrazione cellulare separazione da materiale insolubile (chiarificazione dell estratto) isolamento della isolamento frazione cellulare della frazione di membrana, solubilizzazione tecniche cromatografiche (logica nella sequenza)

27 Utilizzando tali metodiche si ottiene: UN ESTRATTO PROTEICO TOTALE PER ISOLARE LA PROTEINA di INTERESSE Metodiche sequenziali per il frazionamento (separazione) delle diverse proteine presenti nell estratto Cromatografia Scambio ionico Gel filtrazione Interazione idrofobica Di affinità

28 Cromatografia a scambio ionico

29 Gradiente salino: il tampone di eluizione è a concentrazione salina Crescente, elevate concentrazioni saline tendono a distruggere le interazioni elettrostatiche

30 Cromatografia per filtrazione su gel (gel-filtrazione)

31 Si determina il Kav di sostanze a peso molecolare noto

32 Cromatografia di affinità

33 Durante la procedura di purificazione occorrono inoltre metodiche per: identificare univocamente la proteina da purificare al fine di seguirne il processo di purificazione valutare la presenza delle proteine totali (metodi ottici) enzima attività enzimatica proteine proprietà ottiche antigene reazione con anticorpo SAGGIO DI ATTIVITA Dopo ogni stadio di purificazione il campione proteico si arricchisce della proteina di interesse in seguito all allontanamento delle altre proteine (Proteine totali) dette contaminanti

34 DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE TOTALE DELLE PROTEINE IN UN CAMPIONE Metodo diretto: assorbimento a 280 nm Metodi indiretti: Biureto: Formazione di complessi colorati tra Cu ++ ed i legami peptidici (550nm) Lowry: Biureto e riduzione con acidi fosfomolibdotungstici (750 nm) Bradford: Formazione di complessi tra proteine ed il coomassie si forma un prodotto colorato che assorbe a 595nm

35 Determinazione della concentrazione proteica mediante spettrofotometria Spettro di assorbimento UV-VIS VIS di una proteina Assorbimento Picco di assorbimento di Tirosina, Triptofano e Fenilalanina (nm)

36 Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine determina massimo di assorbimento del colorante a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976) OCH 2 CH 3 Coomassie Brilliant Blu R Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi amminici e carbossilici HN N SO 3 Na unico passaggio: il colorante è aggiunto ai campioni e si determina l assorbanza a 595 nm N+ SO 3 Na

37 La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione. Curva standard per ogni saggio 1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml 8 mg/ml 16 mg/ml X mg/ml

38 LA LEGGE DI LAMBERT-BEER I t / I 0 =10 -εcl l = il cammino ottico (cm) c = concentrazione molare del soluto ε = coefficiente di estinsione molare, costante caratteristica di ogni soluto ma il log I 0 /I t = E = ε c l E = ε c l E= Densità ottica o ASSORBANZA è direttamente proporzionale alla concentrazione del soluto che sta assorbendo la luce

39 µg di proteina Intensità del colore blu Assorbanza a 595 nm

40 Ogni passaggio della procedura di purificazione viene determinata: la quantità di proteine totali e le unità di attività enzimatica della proteina di interesse. Una unità enzimatica (U) è definita come la quantità di enzima richiesta per convertire 1 µmol di substrato in prodotto in 1 min in condizioni definite (generalmente 25 o 30 C, ad un valore di ph ottimale). RESA mg o U di proteina di interesse nella frazione mg o U di proteina di interesse nella preparazione originale Il grado di purezza è espresso come: ATTIVITA SPECIFICA ATTIVITA SPECIFICA U di enzima di interesse nella frazione mg di proteine totali nella frazione

41 Nel corso di una purificazione ottimale la resa diminuisce e l attività specifica aumenta

42 Tabella di purificazione dell enzima NADH ossidasi da 120 g di cellule batteriche Stadio di purificazione Proteine totali (mg) Attività Totale (Unità) Attività Specifica (U/mg) Resa (%) Arricchimento (n. volte) omogenato , Centrifugazione , (fraz. Solubile) Precipitazione , Con (NH 4 ) 2 SO 4 DEAE-Sepharose 4,3 5,1 1, Cromatografia di affinità 1,1 4,7 4, Gel fitration 0,54 4,3 8,

43 Purificazione dell'inibitore della tripsina da endosperma di grano (Wheat Trypsin Inhibitor) passaggi Vol (ml) Proteina (mg) Attività specifica Resa % Unità totali estrazione salina frazionamento con (NH 4)2SO Sephadex G CM -sepharose CL 6B Mono S purificazione : 4802/25 = 192 volte

44 Fissaggio del gel in metanolo e acido acetico Colorazione con Blu di Coomassie Valutazione della PUREZZA DEI CAMPIONI DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE delle proteine rispetto a STANDARD DI RIFERIMENTO Nell esempio la purificazione dell enzima RNA Polimerasi da E.Coli

45 X X

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47 Esempio di purificazione di una proteina