Genetica batterica. Giovanni Di Bonaventura, PhD, B.Sc.

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1 Genetica batterica Giovanni Di Bonaventura, PhD, B.Sc. Centro Scienze dell Invecchiamento (Ce.S.I.) Fondazione Università G. d Annunzio (lab) (cell) gdibonaventura@unich.it

2 Genoma batterico Il genoma batterico (o nucleoìde) consta di due componenti: - Cromosoma (geni essenziali) - Elementi extracromosomici mobili (MGEs) (non essenziali, responsabili del trasferimento genetico orizzontale o verticale) - plasmidi - elementi trasponibili - sequenze di inserzione - trasposoni - elementi invertibili

3 Cromosoma batterico Singolo (microrganismi aploidi) DNA bicatenario DNA (prevalentemente) circolare lineare in Streptomyces coelicolor e Borrelia burgdorferi Mosaico in natura soggetto agli effetti del trasferimento genetico orizzontale (contiene geni di diversa provenienza) Trasferimento genetico orizzontale il trasferimento (e successiva integrazione) di geni tra diverse cellule Dimensioni variabili ( Mb; m) Replicazione bidirezionale, da una singola origine

4 Replicazione DNA batterico Escherichia coli: cromosoma rilasciato in seguito a lisi batterica

5 MGEs: Plasmidi Elementi genetici extracromosomici in grado di replicarsi autonomamente Episoma = plasmide in grado di integrarsi nel cromosoma batterico DNA bicatenario circolare (lineare in Streptomyces spp) Presenza di numerosi e caratteristici (gruppi di compatibilità) plasmidi in un singolo batterio: dimensioni = 1/k n. copie Qualità dell informazione genetica Scarsa omologia ( estranei ) con il cromosoma e raramente indispensabili per la sopravvivenza e moltiplicazione batterica in condizioni ottimali Informazione per replicazione indipendente (se unica informazione = plasmidi criptici ) Codificano per fattori di virulenza batterica: Produzione di pili, tossine, adesine, siderofori, Fattori R: determinanti dell antibiotico-resistenza Plasmidi F: sessuali o coniugativi Plasmidi F (Hfr): integrati nel cromosoma (alternanza tra forma libera ed integrata = episoma)

6 Plasmidi

7 Duplicazione rolling circle di DNA-plasmidi 1. Plasmide circolare 2. Rottura di una catena nick 3. Spiazzamento di catena Punto di nuova sintesi di DNA 5 Catena spiazzata 4. Sintesi DNA DNA sintetizzato 5. Termine replicazione, ligazione Replicazione discontinua 3 3 Roll 5 Roll una catena completa

8 Altri MGEs: Elementi trasponibili (1 di 2) Caratteristica traslocazione tra elementi diversi (cromosoma, plasmidi) del genoma batterico. Generalmente, la traslocazione avviene all interno della STESSA cellula (a differenza dei meccanismi di trasferimento di materiale genetico) eccezione: trasposoni coniugativi (coniugazione) Due meccanismi di trasposizione: conservativa nessuna duplicazione di elemento replicativa duplicazione di elemento La trasposizione induce un effetto mutageno : mutazione letale mutazione non letale

9 Altri MGEs: Elementi trasponibili (1 di 2) Sequenze di Inserzione (IS) piccole dimensioni ( bp), integrazione sito-specifica mediante sequenze invertite e ripetute, core codificante solo per trasposizione (solo effetto mutageno). Trasposoni rilevanti dimensioni (> bp), integrazione sito-specifica mediante IS, core contenente uno o più geni (es. geni per farmaco-resistenza).

10 Altri MGEs: Elementi trasponibili (2 di 2) Elementi invertibili oltre a geni codificatori per la trasposizione, presenza di DNA-invertasi capace di invertire l elemento di 180 (rispetto ad un asse centrale virtuale) nella sua locazione cromosomica variazione di fase flagellare H1/H2 in Salmonella Isole genomiche integrate nel cromosoma mediante fago, veicolano geni per la patogenicità (pathogenicity island) e per la vita simbiontica

11 Meccanismi di variazione batterica Mutazione genica Trasferimento genico e ricombinazione Coniugazione Trasformazione Trasduzione Conversione lisogenica Fusione del protoplasto

12 Mutazioni Mutazione = modificazione della sequenza nucleotidica Mutazioni spontanee ( bp / generazione) insorte durante la duplicazione del DNA (low frequency) o in seguito a fenomeni di inversione/traslocazione (high freq.). Mutazioni indotte da agenti mutageni chimici (ag. alchilanti, ac. nitrico, 5-bromouracile), fisici (raggi X, U.V.), biologici (virus) Tipologie: Mutazioni MICROlesionali (puntiformi): Transizione (sostituzione tra basi puriniche/pirimidiniche) Transversione (sostituzione base pur/pirim con base pirim/pur) Frameshift (inserzione o perdita di una base) Mutazioni MACROlesionali: Delezione (di sequenze) Duplicazione (di sequenze) Inversione e Traslocazione (di sequenze) Effetti sul fenotipo: Generalmente, sono compatibili con la sopravvivenza del batterio, grazie alla sua eterogeneità genetica Mutazioni missense (silente: sequenza aa immutata), nonsense (STOP codon), frameshift (sequenza aa modificata) Possono essere letali

13 Mutazioni missense (transversione), nonsense e frameshift

14 Coniugazione Coniugazione = trasferimento genico unidirezionale mediato da plasmide che richiede un contatto fisico tra due cellule batteriche: Pilo sessuale (Gram-negativi) Ferormoni (Gram-positivi) Plasmidi coniugativi plasmidi che possono essere trasferiti tra cellule mediante coniugazione Plasmide F plasmide della fertilità (F fertility) geni rep codificano per la replicazione geni tra - codificano per il trasferimento geni mob - codificano per la mobilizzazione 4 elementi IS mediano l integrazione nell endogenote

15 Coniugazione: tipi cellulari Cellula F + - cellula contenente un plasmide F - (cellula donatrice o maschile ) Cellula F - - cellula non contenente un plasmide F - (cellula ricevente o femminile ) Cellula Hfr cellula contenente un plasmide F integrato nel cromosoma (Hfr high frequency of recombination) - (cellula donatrice o maschile ) Pilo sessuale struttura superficiale prodotta da cellule F + che media lo specifico contatto tra cellule F + e F -, ed il trasferimento del plasmide

16 Coniugazione: F + x F F + (donatore) contenente un plasmide F + codificante per il pilo sessuale. 2. Formazione coppia coniugativa. Rottura in orit di una catena del plasmide F Retrazione del pilo sessuale e formazione di un ponte intercellulare. Una catena del plasmide F + entra in F Sintesi della catena complementare di F + in entrambi i batteri, adesso in grado di produrre il pilo sessuale. 2 3 Nella coniugazione F+ x F- non si assiste a trasferimento di DNA cromosomico 4

17 Coniugazione: F+ x F-

18 Coniugazione: Hfr x F - 1. Formazione Hfr: inserzione di un plasmide F+ nel nucleoide del batterio accettore. 2. Formazione coppia coniugativa. Rottura monocatenaria del DNA a livello del plasmide F + integrato. 3. Retrazione pilo sex e formazione ponte intercellulare. Ingresso del DNA monocatenario nel batterio accettore. Interruzione spontanea della coniugazione: solo una parte del DNA donatore verrà trasferita all accettore. 4. Il donatore sintetizza una copia complementare del DNA rimanendo Hfr. L accettore sintetizza una catena complementare del DNA trasferito Degradazione (nessun effetto) 1 3 -Circolarizzazione (plasm. coniugativo) -Integrazione (nuovi caratteri)

19 Integrazione del plasmide F nel cromosoma a formare una cellula Hfr plasmide F cellula F + sequenze di inserzione (IS) nel plasmide IS3 gd IS3 IS2 integrazione del plasmide F cellula Hfr plasmide F IS ricombinazione omologa tra elementi IS plasmide F integrato cromosoma IS

20 Coniugazione: Hfr x F-

21 Pilo F Cellula F + Cellula F -

22 Coniugazione nei Gram+ Enterococcus faecalis Produzione e rilascio di ferormoni da parte della cellula accettrice (femminile) Ferormoni inducono produzione della sostanza aggregante alla superficie della cellula donatrice (maschile) Formazione di aggregati cellulari con trasferimento del plasmide coniugativo

23 Significato della coniugazione Significato clinico: Principale meccanismo di trasferimento di geni per l antibiotico-resistenza Trasferimento di geni codificanti per fattori di virulenza (enterotossine, adesine, siderofori) Significato ambientale: Trasferimento di resistenza a erbicidi ed idrocarburi aromatici Resistenza batterica ai metalli pesanti Trasferimento di geni per la fissazione dell azoto tra Rhizobia Plasmidi Ti da Agrobacterium possono trasferire geni alle piante (meccanismo di trasferimento genico tra Domini) Significato evoluzionistico: Principale meccanismo evolutivo/adattativo batterico

24 Trasformazione Assunzione di frammenti di DNA solubile dall ambiente circostante da parte di cellule batteriche competenti (Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Pneumococcus) Meccanismo di trasferimento genetico evoluto da una primitiva esigenza nutrizionale Influenzato da: Dimensioni DNA Sensibilità DNA a nucleasi Competenza della cellula accettrice naturale o indotta artificialmente

25 Scoperta della trasformazione (Griffith, 1928) Streptococcus pneumoniae

26 Scoperta della trasformazione (Griffith, 1928)

27 Avery, McCarty e McLeod (1944) identificarono nel DNA la sostanza trasformante

28 Trasformazione batterica 1 1. Morte e degradazione del batterio donatore. 2. Un frammento di DNA bicatenario (ds) interagisce con specifiche proteine (DNAbinding protein) alla superficie della cellula competente. Il DNA è reso monocatenario (ss) da una nucleasi. 3. La proteina Rec A promuove la ricombinazione omologa tra il DNA ss donatore e quello ss recipiente. 4. Lo scambio è completato. Formazione di heteroduplex: una sola delle cellule figlie risulterà essere trasformata

29 Trasformazione batterica

30 Trasformazione batterica: competenza La cellula accettrice, per poter essere trasformata, deve trovarsi in una particolare condizione che prende il nome di competenza Competenza capacità cellulare di catturare il DNA. Fattore di competenza (Gram+) induce: modificazioni di parete cellulare (autolisina) formazione/attivazione di proteine DNA-binding e nucleasi competenza naturale (Bacillus, Neisseria spp.) competenza indotta artificialmente (P. aeruginosa, E. coli, S. typhimurium) trattamento a freddo con CaCl 2 (bassa efficienza, utilizzato di routine nel clonaggio di DNA in E. coli) - elettroporazione

31 Trasformazione batterica nei Gram- Mancanza del fattore di competenza, sostituito da particolari condizioni del mezzo colturale: Ad esempio, 100% competenza in Haemophilus spp. in condizioni permissive per la sintesi proteica ma non per la crescita completa.

32 Significato della trasformazione Significato biotecnologico: Clonaggio di geni utili Significato evoluzionistico: Meccanismo di evoluzione/adattamento batterico

33 Trasduzione La trasduzione consiste nel trasferimento di frammenti di DNA tra due cellule batteriche mediante un batteriofago (virus batterico). Esistono 2 tipi di trasduzione: 1. Trasduzione generalizzata: (teoricamente) qualsiasi gene può essere trasferito 2. Trasduzione specializzata: solo specifici geni possono essere trasferiti

34 Batteriofago T4 infetta Escherichia coli

35 Trasduzione 1 generalizzata (1 di 2) 1. Un fago litico adsorbe ad un batterio sensibile. 2. Penetrazione del genoma fagico nel batterio. Utilizzo dei sistemi metabolici cellulari per la sintesi e l assemblaggio delle componenti virali In alcuni casi, un frammento di DNA batterico o un plasmide possono essere erroneamente inseriti in alcuni capsidi virali (particelle trasducenti). 3

36 Trasduzione generalizzata (2 di 2) 4 4. Rilascio dei fagi batterici in seguito a lisi batterica. 5. Il fago trasduttore adsorbe ad un batterio sensibile Penetrazione del DNA fagico. 7. DNA fagico ricombina con il DNA della cellula accettrice. 7 6

37 Trasduzione generalizzata

38 Trasduzione 1 specializzata (1 di 2) 1-2. Un fago temperato adsorbe al batterio sensibile e vi inietta il suo genoma. 3. Il genoma fagico ricombina con il nucleoide batterico divenendo un profago. 4. In presenza di stimoli adeguati, un frammento del DNA batterico viene escisso come parte del genoma fagico

39 Trasduzione specializzata (2 di 2) 5 5. Durante la replicazione fagica il DNA batterico viene inserito nel genoma fagico. Tutti i fagi veicolano il frammento di DNA batterico. 6. Il fago adsorbe ad una batterio sensibile iniettandovi il suo genoma. 7. Il genoma fagico contenente il DNA trasdotto ricombina con il nucleoide della cellula accettrice. 6 7

40 Trasduzione specializzata

41 Adattamento ed evoluzione batterica Mutazione e selezione classiche (Selezione naturale ed evoluzione) Acquisizione di geni da altri batteri - Trasferimento genico ORIZZONTALE: - Coniugazione - Trasformazione - Trasduzione Ricombinazione genica (omologa o sito-specifica) Trasferimento genico VERTICALE La ricombinazione genica è coinvolta in ogni fenomeno generante variabilità genica

42 Quantità (valori percentuali) di DNA atipico (trasferito) nei genomi batterici Circa il 13% del genoma di E. coli K12 è stato acquisito mediante trasferimento genico orizzontale.

43 Ricombinazione genica Scambio fisico di materiale genetico tra due molecole di DNA Importante processo evolutivo in quanto promuove la diversità genetica (permettendo un rapido adattamento) Coinvolta nella coniugazione, trasformazione, trasduzione e trasposizione Ricombinazione tra DNA lineare (a) e plasmidico (b).

44 Ricombinazione genica A) Ricombinazione OMOLOGA scambio genetico tra sequenze di DNA omologhe Molto complessa - in E.coli richiede oltre 25 geni, Alcuni prodotti genici coinvolti: RecA catalizza la ricombinazione, ubiquitaria nei procarioti RecBCD attività nucleasica ed elicasica proteine leganti DNA singola elica - stabilizzano il DNA a singola elica B) Ricombinazione SITO-SPECIFICA: trasposizione (nella trasposizione) meccanismo integrasi-mediato (nei fagi) trasposoni integrativi e coniugativi

45 Ricombinazione omologa nei batteri Meccanismo e Tipologie

46 Conversione lisogenica Integrazione del genoma fagico mediante ricombinazione sitospecifica DNA profagico silente Occasionale (essiccamento, U.V., radiazioni ionizzanti, agenti mutageni) derepressione di parte del DNA profagico Espressione di numerose proprietà patogene dei batteri: Produzione di tossine (tox difterica, indotta da carenza di Fe 3+ ) Adesine ed antigeni di superficie (Salmonella O antigen)

47 Fusione del protoplasto Protoplasto = citoplasma + nucleo Fusione di due protoplasti trattati con lisozima e penicillina