Il genoma dei batteri è organizzato in operon. Un operon è una unità trascrizionale indipendente, formata da (2-15) geni regolati da un solo promotore

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2 Il genoma dei batteri è organizzato in operon Un operon è una unità trascrizionale indipendente, formata da (2-15) geni regolati da un solo promotore I geni di un operon sono diversi, ma concorrono allo sviluppo di una medesima funzione

3 IL PROMOTORE DEI BATTERI L RNA POLIMERASI riconosce alcune sequenze nucleotidiche nella regione del promotore, al 5 dell inizio di trascrizione L RNA POLIMERASI si lega direttamente a queste regioni del promotore, senza la necessità di fattori di trascrizione. Le sequenze dei promotori dei Procarioti sono altamente conservate in due specifiche regioni (-10 e -35 dall inizio della trascrizione)

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5 Nei batteri è presente un solo tipo di RNA polimerasi Il fattore s lega in modo sequenza-specifico il promotore e promuove il legame della porzione catalitica La porzione catalitica per la sintesi di una molecola di RNA sullo stampo di una singola elica di DNA è formata dal complesso wa 2 bb Il genoma dei batteri codifica per pochi diversi fattori s w a a s b b s = sigma; w = omega; a = alfa; b = beta e beta

6 Stadio lento : L RNA polimerasi lega il complesso dei fattori di trascrizione sul promotore, apre la doppia elica di DNA ed inizia a fare RNA Stadio veloce : L RNA polimerasi cambia conformazione, lega i fattori di elongazione e la sintesi di RNA procede a grande velocità Il complesso dei fattori di trascrizione resta legato al promotore, arriva un altra RNA polimerasi il ciclo si ripete

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8 Nei batteri la trascrizione e la traduzione sono quasi simultanee: mentre ancora si svolge la trascrizione dell mrna, un primo ribosoma si lega ed inizia la sintesi proteica poco dopo, un secondo ribosoma si lega ed inizia una nuova sintesi proteica

9 Operon del Triptofano Il battere trascrive e traduce l operon del triptofano soltanto quando questo amminoacido non è disponibile in quantità adeguata. La trascrizione nei batteri deve quindi essere regolata. La regolazione dipende da proteine che assumono due conformazioni, di cui solo una può legare il DNA. L operon del triptofano esempio di regolazione negativa.

10 OPERON del Triptofano: REGOLAZIONE NEGATIVA In presenza di triptofano, il complesso triptofano/repressore si lega al promotore dell operon impedendo alla RNA polimerasi di trascrivere Il legame triptofano/repressore è un legame con bassa affinità, dipende quindi dalla concentrazione del triptofano nel battere Quando il triptofano sta per finire, il repressore si distacca dal promotore permettendo la trascrizione Repressore/triptofano attivo Repressore inattivo RNA polimerasi

11 Promotore Operatore Geni dell Operon DNA Repressore attivo Repressore attivo Triptofano La regolazione negativa di un operon dipende da una proteina che, cambiando conformazione, si può legare alla sequenza operatore nel promotore impedendo così alla RNA polimerasi di legarsi e di trascrivere l operon Repressore inattivo Repressore inattivo Lattosio Operon LAC Operon TRP

12 LATTOSIO Galattosio Glucosio

13 1) Presenza di solo glucosio = OPERON OFF IL BATTERE METABOLIZZA GLUCOSIO 2) Presenza di solo lattosio = OPERON ON IL BATTERE METABOLIZZA LATTOSIO? 3) Presenza di glucosio e lattosio = OPERON OFF Conseguenze della regolazione positiva dell Operon Lac

14 Operon Lac L operon LAC è soggetto a doppia regolazione sia negativa che positiva. Le tre proteine codificate dai tre geni dell operon LAC sono: la b-galattosidase, un enzima che idrolizza il lattosio formando glucosio e galattosio (codificato dal gene X); la b-galattoside permeasi, un enzima della membrana che trasporta il lattosio dentro la cellula (codificato dal gene Y); L enzima codificato dal gene Z produce la b-galattoside transacetilasi, un enzima che trasforma il galattosio in glucosio.

15 Il Lattosio è un disaccaride formato da galattosio e glucosio. Galattosio Glucosio Il Lattulosio è un disaccaride formato da galattosio e fruttosio. Il Saccarosio è un disaccaride formato da glucosio e fruttosio. Glucosio Fruttosio Galattosio Fruttosio

16 REGOLAZIONE POSITIVA DI UN OPERON In presenza di glucosio, il battere usa glucosio ma: tiene in uno stato di pre-allerta i promotori di operon che permettono l impiego di fonti di cibo alternative che sono presenti nell ambiente circostante, pronto ad attivarli non appena il glucosio dovesse improvvisamente finire tiene in uno stato di completa inattivazione i promotori di operon che permettono l impiego di fonti di cibo alternative che NON sono presenti nell ambiente circostante

17 L interazione della RNA polimerasi assemblata sul promotore dipende dalla sequenza del DNA del promotore ed influenza l inizio della trascrizione w a s b b Promotore forte w s b Promotore debole a b

18 A causa della regolazione negativa: 1) quando c è solo glucosio, l operon LAC è OFF ed il battere metabolizza glucosio 2) quando c è solo lattosio, l operon LAC è ON ed il battere metabolizza glucosio ottenuto dal lattosio 3) quando c è sia glucosio che lattosio, l operon LAC sarebbe inevitabilmente ON con la conseguenza che il battere sprecherebbe energia producendo glucosio dal lattosio 4) in effetti, a causa del promotore debole, la trascrizione resta OFF nonostante che l RNA polimerasi sia legata al promotore A causa della regolazione positiva: a) la trascrizione si verifica solo quando il glucosio sta per finire e questo fatto consente al battere di sopravvivere quando il glucosio non è più reperibile nell ambiente

19 QUANDO IL GLUCOSIO STA PER FINIRE membrana cellulare camp PROTEINA DI REGOLAZIONE INATTIVA PROTEINA DI REGOLAZIONE ATTIVA

20 Triptofano alta costante di affinità (Km) Aminoacil-tRNA sintetasi Repressore operon TRP bassa costante di affinità (Keq) Lattosio bassa costante di affinità (Km) Enzimi del metabolismo Repressore operon LAC alta costante di affinità (Keq) poco triptofano poco lattosio

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22 La formazione dei complessi di proteine avviene sulla base della complementarietà delle superfici, rispettando l ordine

23 RNA polimerasi I trascrive per il pre-rrna che, maturando nel nucleolo, origina i vari rrna che saranno poi assemblati con proteine provenienti dal citosol per costruire le due subunità del ribosoma

24 La trascrizione dei geni in vivo può chiamare in causa contemporaneamente più RNA polimerasi gene 4 gene 1 gene 2 gene 3 DNA RNA RNA polimerasi

25 NUCLEOLO

26 I geni necessari per l assemblaggio dei ribosomi sono un MODULO FUNZIONALE Alla costruzione del ribosoma partecipano: - i trascritti della RNA Pol I (rrna) - varie decine di proteine sintetizzate nel citosol dalla traduzione di trascritti della RNA Pol II (mrna) relativi a geni per le proteine costituenti il ribosoma ed enzimi per la maturazione dei vari rrna nel nucleolo - vari piccoli RNA trascritti dalla RNA Pol III che guidano la maturazione degli rrna nel nucleolo e la formazione del ribosoma (RNA 5S)

27 RNA polimerasi III: trna (RNA transfer) mirna (microrna) snorna (small nucleolar RNA) tirna (triplex irna) snrna (alcuni small nuclear RNA) grna (RNA guida) SRP-RNA RNA della telomerasi Xist RNA pirna (piwi RNA) silenziamento di geni e retrotrasposoni

28 Negli eucarioti, la sequenza CCA all espremità 3 viene aggiunta enzimaticamente, un nucleotide alla volta, usando due molecole di CTP ed una molecola di ATP

29 La RNAse P è un ribozima che interviene nel processo di maturazione dei trna

30 L amminoacido corrispondente all anticodone verrà aggiunto nel citosol da amminoacil-trna sintetasi, utilizzando l energia liberata dall idrolisi di ATP Questi enzimi sanno legare nucleotide contenente adenina da due nucleotidi contenenti l amminoacido ad un che è preceduto citosina (CCA) 7 bp acceptor stem H 2 C H 2 C O N NH O O NH HN O pseudouridine ( dihydrouridine (UH 2 )

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