Tecnica di preparazione di vetrini istologici. By A. Pirola

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Flaviano Mele
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1 Tecnica di preparazione di vetrini istologici By A. Pirola

2 Preparazione del materiale istologico Problema 1 I tessuti vanno incontro a fenomeni di degradazione Problema 2 La luce può attraversare solo sezioni molto sottili Problema 3 La maggior parte dei tessuti sono molli Problema 4 Prima dell osservazione il tessuto deve essere colorato

3 Schema di preparazione di un vetrino

4 Fasi della preparazione Prelievo del materiale Fissazione 1 Taglio (bisturi) 1 a Disidratazione Inclusione in paraffina 2 Taglio (microtomo) Deparaffinatura e Idratazione Colorazione 2 a Disidratazione Montaggio

5 Prelievo del materiale Strumenti per il prelievo Bisturi Punch per biopsia Pinze per biopsia Aghi per biopsia Raschietti Tamponi

6 Prelievo del materiale

7 Prelievo del materiale

8 Prelievo del materiale

9 Fissazione Scopo della fissazione fissativi coagulanti (denaturano le proteine) etanolo acido picrico al 2% cloruro mercurico al 7 % fissativi non coagulanti (gelificano le proteine) formaldeide in soluzione al 10% (formalina) acido acetico tetrossido d osmio 7% (usato in microscopia elettronica) congelamento rapido in azoto liquido ed essiccazione

10 1 Taglio e 1 a Disidratazione Scopo del 1 taglio Scopo della 1 a disidratazione Etanolo 80% Etanolo 90% Etanolo 95% Etanolo 100% Xilolo

11 1 a Disidratazione

12 Inclusione in paraffina Scopo dell inclusione Paraffina Resine epossidiche (microscopia elettronica)

13 Inclusione in paraffina

14 Inclusione in paraffina

15 Inclusione in paraffina

16 2 Taglio Scopo del 2 taglio Microtomo a slitta Microtomo a rotazione Microtomo elettronico Microtomo congelatore Spessore sezioni sottili 2 10 µm (microscopia ottica) Å(microscopia elettronica)

17 2 Taglio

18 2 Taglio

19 2 Taglio

20 Recupero delle sezioni sottili 2 Taglio

21 Deparaffinatura e Idratazione Scopo deparaffinatura Scopo idratazione Xilolo Etanolo 100% Etanolo 95% Acqua distillata

22 Colorazione Scopo della colorazione Caratteristiche delle colorazioni istologiche Semplici Differenziali Simultanee Successive Progressive Regressive Dirette Indirette Metacromatiche

23 Colorazione Ematossilina Eosina REAGENTE RISULTATO Blu: nucleo, regioni acide del citoplasma, matrice cartilaginea Rosa: regioni basiche del citoplasma, fibre collagene Colorazione tricromica di Masson Orceina per le fibre elastiche Weigert per le fibre elastiche Argento Ematossilina ferrica Acido periodico-schiff Colorazione Amiloide di Thompson Colorazione di Pearls Blu scuro: nucleo Rosso: muscoli, cheratine, citoplasma Blu chiaro: mucinogeno, collagene Marrone: fibre elastiche Blu: fibre elastiche Nero: fibre reticolari Nero: striature muscolari, nucleo, eritrociti Magenta: glicogeno e molecole ricche di carboidrati Blu: nucleo Rosa o rosso: amiloide Rosso: nucleo Blu: ferro

24 Colorazione

25 Colorazione Colorazione Ematossilina-Eosina Ematossilina (basica) colora in viola le strutture acide Eosina (acida) colora in rosa le strutture basiche

26 Colorazione Colorazione Azan-Mallory Azocarminio colora in rosso i nuclei e in rosa il citoplasma Miscela di Mallory colora in blu le fibre collagene

27 Colorazione Nella microscopia elettronica i campioni si colorano mediante impregnazione con Sali di metalli pesanti (oro, palladio, osmio, ecc.)

28 2 a Disidratazione Scopo della 2 a disidratazione Etanolo 95% Etanolo 100% Xilolo

29 Scopo del montaggio Montaggio

30 Cenni di Istochimica

31 Istochimica L'istochimica è lo studio della composizione chimica delle strutture dei tessuti biologici attraverso metodi microscopici Le colorazioni istochimiche consentono l identificazione delle sostanze chimiche contenute nei tessuti, queste reazioni non devono danneggiare le cellule e devono provocare la formazione di sostanze colorate insolubili

32 Caratteristiche delle Reazioni Istochimiche Dirette Indirette Specifiche Assoluta Non assoluta Sensibili Sicure

33 Il problema dei fissativi Tutti i fissativi usati nelle metodiche istologiche comportano modificazioni chimiche delle strutture in esame In questo caso si ricorrere al congelamento dei campioni Microtomo congelatore Criostato Congelamento rapido in azoto liquido ed essiccazione

34 Tipi di colorazione Proteine Reazione Ninidrina-Schiff

35 Tipi di colorazione Acidi nucleici Reazione di Feulgen

36 Tipi di colorazione Carboidrati Reazione PAS Reazione con Alcian Blu

37 Tipi di colorazione Lipidi Lisocromi

38 Istoenzimologia L istoenzimologia si prefigge di localizzare attività enzimatiche nei tessuti ed all interno di cellule A questo scopo si utilizzano reazioni chimiche catalizzate dagli enzimi tissulari, che forniscono un prodotto insolubile e visibile in microscopia L'identificazione di un enzima è in realtà un artefatto, in quanto è il prodotto della reazione che si osserva al microscopio, non l'enzima

39 Istoenzimologia Metodo per la Fosfatasi alcalina (ALP)

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