ANEMIE EMOLITICHE. Francesco Lanza. Azienda Istituti Ospitalieri Cremona. UO di Ematologia e Centro Trapianti di Cellule Staminali
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1 ANEMIE EMOLITICHE Francesco Lanza UO di Ematologia e Centro Trapianti di Cellule Staminali Azienda Istituti Ospitalieri Cremona
2 R Normali o ridotti Anemia emocromo + reticolociti Iperproduzione Midollare (ret ) Morfologia eritrocitaria EMORRAGIA - EMOLISI Normocitica Normocromica ipoproliferazione DANNO DANNO MIDOLLARE MIDOLLARE -Infiltrazione -Infiltrazione -Aplasia -Aplasia RIDOTA RIDOTA PRODUZIONE PRODUZIONE -Flogosi -Flogosi -Danno -Danno renale renale Microcitica Macrocitica Disordine maturativo ALTER. ALTER. CITOPLASMATICHE CITOPLASMATICHE --Carenza Carenza di di ferro ferro --Talassemia Talassemia --Anemia Anemia sideroblastica sideroblastica ALTER. ALTER. NUCLEARI NUCLEARI --carenza carenza folati folati e B12 B12 --anemia anemia refrattaria refrattaria D. D. INTRAGOLOBULARE Sferocitosi Sferocitosi Carenza Carenza di di G6PD G6PD Falciforme Falciforme D. D. EXTRAGOLOBULARE Autoanticorpi Autoanticorpi Danno Danno microcircolo microcircolo
3 Classificazione anemie su base fisiopatologica e cinetica Da emorragia Da iperemolisi intraglobulari extraglobulari Ridotta sopravvivenza GR membrana Enzimopatie Catene globiniche Meccanici Chimici e fisici Autoanticorpi Sferocitosi EPN G6PD, PK Falcemia Talassemia Microangiopatica Protesi valvolari Piombo veleni AEA
4 ANEMIE EMOLITICHE IMMUNI ANEMIE EMOLITICHE AUTOIMMUNI: a. macrocitica ipercromica disomogenea (MCV, MCH, RDW aumentati), con reticolocitosi Atc caldi (IgG) Atc freddi (IgM) Atc bitermici (lisanti o agglutinanti)
5 Anemia immunoemolitica: sferociti, macrociti e reticolocitosi. Nelle cellule più grandi si vede materiale reticolare (RNA precipitato). Colorazione con blu di metilene (Controcolorazione con Giemsa)
6 Principali indici eritrocitari Parametro Significato Ruolo MCV Volume cellulare medio (misurato direttamente) Classificazione e diagnosi anemie RDW Ampiezze della distribuzione dei diametri eritrocitari Indice di anisocitosi Differenza tra anemia sideropenica e talassemia % microciti GR con diametro inferiore a soglia prestabilita % macrociti GR con diametro superiore a soglia prestabilita Diagnosi precoce di ferrocarenza Reticolociti, carenza B12,folati Concentrazio ne Hb (MCH, MCHC) Emazie ipocromiche o ipercromiche Svariate condizioni con modificazione dell eritropoiesi
7 Valutazione automatica parametri eritrocitari Curve di distribuzione volume GR ed indici di dispersione Red cell distribution width (RDW) RDW: CV% V dei GR troncato 20% DS distribuzione GR tra percentile MCV (media) X 100 Indice di anisocitosi Canali volumetrici
8 Valutazione automatica parametri eritrocitari Analisi del volume cellulare e della concentrazione emoglobinica cellulare 60 fl 120 fl 24g/dl 41g/dl Volume GR 120 fl 24g/dl 41g/dl 60 fl Concentrazione Hb
9 MEAN CELL VOLUME (MCV) cause di aumento spurio Agglutinazione GR da autoanticorpi freddi (o caldi) Pan-agglutinazione da anticorpi EDTA dipendenti Iperosmolarità plasmatica (ipernatriemia, iperglicemia) Agitazione ripetuta di provetta chiusa (effetto da CO2) Ostruzione parziale dell apertura nei sistemi a resistenza
10 Diverse classi di reticolociti Eritroblasti Ortocromatici (nucleo) Reticolociti da stress (a. emolitica) (sostanza granulo-filamentosa abbondante) Reticolociti soggetto normale (sostanza granulo-filamentosa dispersa)
11 MISURAZIONE AUTOMATICA DEI RETICOLOCITI E DELLA POPOLAZIONE IMMATURA (IRF) Intensità di fluorescenza
12 Reticolocito caratteristiche La sostanza granulofilamentosa è Rna Le dimensioni sono > dei GR (24%) Densità < rispetto GR I reticolociti immaturi esprimono TfR Utilizzo fluorocromi sopravitali per la conta automatica Aumento 20 x fluorescenza di fondo nei R Aumento 1,7 X nei GR Conta in % e valore corretto Conta assoluta
13 MISURAZIONE DI MCV ED MCH RETICOLOCITARI Colorazione con conta fluorocromo Misurazione dell MCV MCVr Misurazione dell MCHC CHCMr Calcolo di MCH CHr Calcolo dell Hct Reticolocitario >24% GR >24% GR < 16% GR < 16% GR = a GR = a GR
14 Potenziali cause di interferenza nella conta automatica dei reticolociti Linfocitosi Piastrinosi Invasione settore di conta Eritroblasti Corpi di Howell-Jolly Corpi di Heinz Basophilic stippling DNA che lega il fluorocromo Porfiria Agenti chimici (B12) angiografia fundus oculi Altra fluorescenza
15 Classificazione dell anemia (Hb g/dl) Grado WHO EORTC < < < < < < < 6.5 < 6.5 Lieve Moderata 10 8 Severa 8
16 The physiological role of erythropoietin in the healthy adult Decreased oxygen delivery to the kidneys Peritubular interstitial cells detect low oxygen levels in the blood EPO Peritubular interstitial cells secrete erythropoietin (EPO) into the blood Pro-erythroblasts in red bone marrow mature more quickly into reticulocytes Increased oxygen delivery to tissues Return to homeostasis when response brings oxygen delivery to kidneys back to normal More reticulocytes enter blood Larger number of red blood cells (RBC) in circulation
17 Emoglobinuria Parossistica Notturna (EPN) Malattia clonale di natura acquisita delle cellule staminali emopoietiche che provoca: 1. Anemia dovuta ad emolisi intravascolare cronica e acuta; 2. Diatesi tromboembolica; 3. Distonia della muscolatura liscia. Rosse, WF. Et al. Hematology 2004 (1):48-62.
18 Rachidi S, Musallam KM, Taher AT. Eur.J Intern.Med. 2010;21: ;
19 Epidemiologia EPN, una malattia orfana molto rara Prevalenza Primo studio francese 220 casi / (Lancet, 1996) 3, aggiornato nel pazienti British registry 140 pazienti dal 1990 Prevalenza 10/milione (7 15,9) Italia?? (ad oggi noti circa 200 pazienti) Età media alla diagnosi : 30 anni 1,2,3 Sopravvivenza media : anni dopo diagnosi 2,4 1 Moyo, et al. Br J Haematol. 2004;126: Socie, et al. Lancet. 1996;348: Nishimura, et al. Medicine. 2004;83: Hillmen, et al. N Engl J Med. 1995;333: Brodsky. Parosysmal Nocturnal Hemoglobinuria. In: Hoffman, R et al., eds. Hematology - Basic Principles and Practices. 4th ed. 2005; p
20 Elevate morbidità e mortalità Incidenza: nuovi casi per milione/anno Mortalità a 5 anni: 35% Diagnosi a tutte le età,, mediana a 30 anni. Malattia progressiva Impatto sulla qualità della vita Sopravvivenza (%) Tempo di sopravvivenza dopo la diagnosi di EPN confronto con controlli sani Controlli sani (appaiati Per età e sesso) Pazienti EPN Anni dopo la diagnosi The expected survival of an age- and sex-matched control group is shown for comparison Hillmen et al 1995.
21 Fisiopatologia I globuli rossi EPN mancano delle proteine di membrana di regolazione del complemento. Tali proteine (CD55( e CD59), impediscono normalmente l attivazione l del sistema del complemento verso le cellule sane. Le cellule EPN ne sono parzialmente (tipo II) o totalmente (tipo III) deficitarie. Parker, et al. Blood. 2005;106:
22 Fisiopatologia L emolisi nell EPN I globuli rossi normali sono protetti dall attaco attaco del complemento dalle proteine GPI-ancorate CD55 e CD59 Attivazione del complemento I globuli rossi EPN, non essendo protetti, vengono lisati Trombosi Danno Renale Ipertensione polmonare Addominalgia Impatto sulla mortalità Dispnea GR intatti Riduzione dei GR Emoglobinemia Affaticamento Disfagia Impatto sulla morbilità Emoglobinuria Anemia disfunzione erettile
23 TROMBOSI Non c è relazione tra i sintomi ed il rischio TEV/TA Trombosi venosa pre-trattamento Trombosi venosa profonda - Arti inferiori - Altre Trombosi venosa mesenterica/splenica Trombosi portale Embolia Polmonare Trombosi venosa cerebrale Trombosi superficiale Trombosi arteriosa pre-trattamento Eventi % ,1% 18,5% 14,5% 18,5% 16,9% 6,5% 5,6% 4,0% Ictus/TIA Infarto miocardico / Angina instabile Total ,7% 1,6% 100%
24 EPN: rilievi laboratoristici Anemia, reticolocitosi Citopenia: neutropenia, trombocitopenia Aumento del valore serico LDH,<aptoglobina Emoglobinuria a poussee Perpetual Hemosiderinuria Ipertensione polmonare Segni di trombosi (dimero D) >50% pts Insufficenza renale Aumento parametri di flogosi (infezioni)
25 Percorso diagnostico dell EPN Anemia emolitica Coombs negativa Emoglobinuria AA MDS Citopenia inspiegata Trombosi Inspiegata (venosa o arteriosa) Citometria ad alta sensibilità Risultati quantitativi Su GR e GB Citometria ad alta sensibilità Risultati quantitativi Su GR e GB Citometria ad alta sensibilità Risultati quantitativi Su GR e GB Conferma o esclusione dell EPN AA +/- EPN MDS +/- EPN Conferma o esclusione dell EPN Il risultato del test riveste un significato in termini prognostici e terapeutici* * Parker, et al. Blood. 2005;106:
26 Classificazione dell EPN Parker et al, Blood 2005 Categorie Emolisi Fibrosi Classica + - EPN in corso di altre patologie midollari (MDS, AA) + + Subclinica - +
27 Emoglobinuria
28 Emosiderinuria
29 Test di Ham in corso di EPN dac ds dac dhi phi pac H20 Control RBC Patient RBC GR Normali GR lisati
30 Clonal origin of PNH cells in a G6PD A/B heterozygous patient G6PD-A G6PD-B Whole RBC PNH RBC Controls Patient Luzzatto L et al. University College Hospital, Ibadan, Nigeria
31 Somatic mutation(s) in the X-linked PIG-A gene Gene F2L XG XGR PIG A Disease / Function Coagulation Factor II like Xg blood group Expression of Xg on Erythrocytes PNH CYBB Chronic granulomatous disease XK Mc Leod s Phenotype THC Thrombocytopenia 1 WAS GF1 Wiskott-Aldrich Syndrome Globin transcriptase factor 1 ASB Anaemia Sideroblastic Hypocromic ALA S2 Aminolevulinate sinthase 2 SCIDX1 Severe Combined Imm. Def. AGMX1 Bruton Agammaglobulinaemia HIGM1 LYP F9 F8C G&PD AGHX2 Hyper IgM Syndrome Lymphoproliferative Syndrome Coagulation Factor IX Coagulation Factor VIIIC Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Agammaglobulinaemia (with GH deficit)
32 Pathogenesis - The Defect GPI Anchor PIG - A gene gene codes for 60 kda protein glycosyltransferase which effects the first step in the synthesis of the glycolipid GPI anchor (glycosylphosphatidylinositol). Results in clones lacking GPI anchor - in turn, attached proteins PIG - A protein
33 PNH Diagnosis by Flow Cytometry Of the long list of GPI anchored protein, monoclonal antibodies to the following antigens have been used in the diagnosis of PNH The most useful Abs are to CD14, 16, 55, 59, and 66. Are all required? Probably not - more studies needed Antigen Cell Lineage Function CD14 monocytes LPS receptor, MDF CD16 neutrophils Fc III receptor CD24 neutrophils B-cell differentiation marker CD55 all lineages DAF CD58 all lineages possible adhesion CD59 all lineages MIRL, HRF, protectin CD66b neutrophils CEA-related glycoprotein
34 Classificazione cellule EPN PNH I PNH II PNH III Cellule Normali Deficit parziale Deficit Completo cell count III II I Intensita di fluorescenza
35 GPI neg /granulociti in soggetti normali Paziente EPN Soggetto Sano CD55, CD59 PE Normal cells 20% Normal PNH PNH cells 80% 10 per million CD11b-FITC Araten DJ et al. PNAS U S A. 1999
36 CD55 CD58 CD59 CD109 PrPC GP500 Gova/b CD55 CD58 CD59 PrPC AChE JMH Ag Dombroch HG Ag CD55 CD58 CD59 CD14 CD16 CD24 CD48 CD66b CD66c CD87 CD109 CD157 LAPNB1 PrPC p50-80 GPI-80 ADP-RT NA1/NA2 Proteins deficient on PNH Platelets blood cells RBC Granulocytes Haematopoietic Stem Cell CD59, CD90, CD109 B cells Monocytes CD14 CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 CD87 CD109 CD157 Group 8 PrPC GPI-80 CD16* T cells CD24 CD58 CD48 CD73 CD55 CD59 CD52 CD108 ADP-RT CD90 CD16 NK cells CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 PrPc CD16 CD55 CD59 PrPC CD108 CD58 CD48 CD87 PrPc CD73 CD109 Courtesy L. Del Vecchio
37 Scape Project 2009 / 2010
38 Studio midollare in corso di EPN: procedura errata a fini diagnostici FLAER Alexa-488
39 Panel for cytometric analysis in patients with suspected PNH Granulocyte Lymphocyte CD66b T CD48 B NK Monocyte Erythrocyte CD14 CD59 Del Vecchio
40 GR in RBC EPN III I CD59
41 Monociti e granulociti: Monitoraggio nel tempo Livello Soglia? 5%
42 EPN: Monociti 3 Popolazioni CD33 CD45 CD14 III II I CD14
43 FLAER vs CD66b FLAER Alexa-488
44 Borowitz MJ, et al. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 78B: (2010)
45 Borowitz MJ, et al. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 78B: (2010)
46 terapia con Eculizumab SOLIRIS Anticorpo monoclonale umanizzato diretto alla proteina C5 del complemento che blocca il terminal complement activation sui GR EPN CL Human IgG2 heavy chain constant region 1 and hinge CH1 Human framework regions Hinge CH2 CH3 Complementarity determining regions (murine origin) Human IgG4 heavy chain constant regions 2 and 3
RETICULOCYTE POLYCHROMATOPHILIC
Erythroid Maturation In the BM PRO POLYCHROMAPHILIC RETICULOCYTE RED BLOOD CELL BASOPHILIC ORTHOCHROMATIC RETICULOCYTE POLYCHROMATOPHILIC RBC PRO BASOPHILIC POLYCHROMATOPHILIC ORTHOCHROMATIC Maturation
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