Beniamino Trombetta, PhD Dipartimento di Biologia e Biotecnologie «Charles Darwin»

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Serafino Vitale
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1 Beniamino Trombetta, PhD Dipartimento di Biologia e Biotecnologie «Charles Darwin» beniamino.trombetta@uniroma1.it

2 Individuare in modo UNIVOCO un individuo (parentela, reati, ecc) da una data traccia biologica. La traccia biologica viene repertata e inviata in laboratorio. La molecola utilizzata per l identificazione personale è il DNA.

3 CARATTERISTICHE DEL DNA Cellula Cromosoma (molecola di DNA impacchettata ) Nucleo Molecola di DNA distesa A T T G A C T A

4 CARATTERISTICHE DEL DNA Le basi non sono altro che «compos2 chimici» organizza2 in una sequenza lineare A T A T G C T L appaiamento segue regole precise Avere la sequenza di un pezzo di DNA significa sapere quale è l ordine dei compos2 chimici che formano la molecola. L unità di misura del DNA è data dal numero di nucleo2di

5 IL GENOMA UMANO Il genoma umano che contiene 3,2 x 10^9 basi è stati sequenziato nel 2001

6 NASCITA DELLA GENETICA FORENSE (L Eureka di Sir Alec Jeffreys) Analisi del DNA sui tecnici di laboratorio Si accorse dell esistenza di differenze e somiglianze riproducibili VNTR: numero variabile di ripetizioni seriali (tandem repeats) (da 9 a 40bp che possono essere ripetute anche centinaia o migliaia di volte, dimensione da 500 a bp)

7 Jeffreys e coll. avevano scoperto che esistono nel DNA umano delle regioni (minisatelliti/vntr= Variable Number Tandem Repeat) 1)..ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG.. 2)..TAGACTGAATGC TAGACTGAATGC TAGACTGAATGC.. vengono ripetute in tandem numerose volte e sono presenti in più loci sui cromosomi. Inoltre, il numero di ripetizioni è altamente variabile nei diversi individui

8 Jeffreys e coll. avevano scoperto che esistono nel DNA umano delle regioni (minisatelliti/vntr= Variable Number Tandem Repeat) INDIVIDUO 1)..ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG.. INDIVIDUO 2)..ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG.. INDIVIDUO 3)..ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG ATCTGACTTACG..

9 ANALISI Fase 1: digestione del DNA Si utilizzano gli enzimi di restrizione. Sono delle forbici molecolari che tagliano (digeriscono) il DNA su entrambi i filamenti in corrispondenza di sequenze specifiche. Numero e lunghezza dei frammenti dipendono dalla frequenza della sequenza sul DNA (sequenze più corte: statisticamente più frequenti).

10 Fase 2: separazione del DNA I frammenti di DNA vengono separati in base alla loro lunghezza attraverso un campo elettrico (elettrofresi). Successione di bande Frammento più lungo Frammento più corto

11 Fase 3: Identificazione del DNA DNA denaturati (singola elica) separati per elettroforesi e trasferiti su una membrana porosa poi immersa nella soluzione con la sonda marcata (tracciante) Southern blotting Il filamento singolo della sonda riconosce la sequenza complementare sul DNA e vi si lega. Una sequenza di DNA può fungere da sonda per identificare segmenti di DNA che hanno sequenza nucleotidica identica o molto simile in base al principio della complementarità delle basi.

12 Lo sviluppo della genetica forense Il DNA fingerprinting Introdotto da Alec Jeffreys Il DNA viene estratto, digerito con enzimi di restrizione, sottoposto ad elettroforesi, denaturato e trasferito su membrana. Quindi viene utilizzata una sonda multi-locus core minisatellite marcata con radioattivo per l ibridazione. Il segnale radioattivo viene rivelato mediante esposizione di una lastra sensibile ai raggi X

13 UN CONCETTO FONDAMENTALE Il dubbio è fastidioso, ma la certezza è degli imbecilli Voltaire SCIENTIFICO ESATTO L approccio è scientifico solo se permette di valutare l indeterminazione associata alle nostre ipotesi Esclusione certa, ma mai certezza assoluta

14 Colin Pitchfork (Leichester, 1983) Il primo caso: il signor Colin Pitchfork 1983: Lynda Mann, 15 anni, viene violentata e uccisa nel Leichestershire (UK) 1986: Dawn Ashworth, 15 anni, viene violentata e uccisa nella stessa zona Il modus operandi nei due delitti era lo stesso ed il gruppo sanguigno (gruppo A), determinato dalle tracce di liquido seminale, era il medesimo (ci volle molto tempo per ottenere un buon profilo di DNA visto il poco materiale a disposizione). 1986: Richard Buckland, un ragazzo del posto, venne incriminato dei due delitti, ma l analisi del DNA mediante fingerprinting rivelò successivamente che egli era innocente. Circa 5000 individui nel Leichestershire possedevano il gruppo sanguigno A. Si organizzò uno screening di massa ed in nessun caso il DNA fingerprinting dei 5000 individui corrispondeva a quello dell assassino. 1987: una persona del posto rivelò che un amico, un certo Colin Pitchfork, gli aveva chiesto di partecipare allo screening in sua vece in cambio di denaro. Il signor Pitchfork venne invitato a donare il sangue ed il profilo del suo DNA risultò identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti. Ci vollero 4 anni per trovare il colpevole (un problema che rimaneva: servivano grandi quantità di DNA)

15 Grandi quantità di DNA

16 1983 La seconda svolta «Ho scoperto la PCR perché avevo tutto quello che mi serviva: una macchina nuova, il serbatoio pieno, un paio di scarpe comode e la donna che amavo che dormiva al mio fianco» Ballano nudi nel campo della mente, (mentre andava a fare SURF)

17 Amplificazione PCR Reazione a Catena della Polimerasi Metodo per amplificare rapidamente un singolo frammento di DNA da una miscela complessa Cicli ripetuti di: 1. Denaturazione al calore 2. Primers (oligonucleotidi) 3. Polimerizzazione con polimerasi Taq (resistente al calore)

18 La PCR supera questo problema

19 Cambia il marcatore molecolare (Non più VNTR ma STR) Con l introduzione della PCR diventa possibile analizzare loci specifici leggermente diversi dai precedenti. AATG 7 repeats 8 repeats

20 Caratteristiche degli STR Alto tasso di mutazione = elevata variabilità nelle popolazioni umane Piccoli frammenti = possibile lavorare anche su campioni degradati o su DNA antico Conoscenza esatta delle frequenze alleliche nelle popolazioni umane = probabilità di match

21 Campione XY Campione YZ Sesso Femminile Sesso Maschile TH TH D21S D21S D18S D18S vwa vwa FGA FGA D8S D8S TPOX 8-8 TPOX CSF1PO CSF1PO D16S D16S D7S D7S D13S D13S D5S D5S D3S D3S D19S D19S D2S D2S

22 La ragione dell uso di primers fluorescenti è legata al fatto che l analisi degli amplificati viene fatta con un sistema automatizzato (Altro Grande Vantaggio!!) di elettroforesi capillare che consente di distinguere gli amplificati sulla base del colore.

24 Sample injection Sample separation Ar + LASER (488 nm) Mixture of dye-labeled PCR product from Multiplex PCR reaction Fluorescence ABI Prism spectrograph Sample Detection CCD Panel Color Separation Il capillare, che contiene una soluzione polimerizzante, è dotato di una finestrella attraverso la quale il laser eccita ad una precisa lunghezza d onda il campione di DNA marcato con un determinato fluoroforo che ne permette l identificazione. Capillary

25 Le bande, la cui dimensione dipende dal numero di ripetizioni, vengono trasformate in picchi.

26 COMPARAZIONE DI PROFILI GENETICI Esclusione Compatibilità

27 PowerPlex ESX 17

28 Familial Searching

29 Palladineve: il gatto che incastrò il killer grazie alla PCR Il 3 ottobre 1994, Prince Edward Island, Canada scompare una donna di 32 anni, successivamente ritrovata morta seppellita in una buca poco profonda. Era il cadavere di Shirley Douglas. Le indagini si concentrarono su una giacca intrisa di sangue. Il sangue era della vittima, ma sulla giacca vengono individuate 27 peli bianchi. Grazie alla PCR il poco DNA dei peli fu amplificato e analizzato: risultò essere di un gatto. L ex convivente della vittima, Douglas Bremish, era tra i sospettati e viveva con un gatto di nome palla di neve Il DNA estratto dai peli di palla di neve presenta un profilo DNA uguale a quello ottenuto dai peli ritrovati nella macchina della vittima L ex marito viene incriminato nel giro di pochissimo tempo e messo alle strette confessa l omicidio I peli di Palla di neve costituirono un precedente tanto che il dipartimento di giustizia statunitense stanziò ben 265mila dollari per creare un database genetico nazionale dei gatti nel caso in cui si fossero trovati altri peli di gatto sulle scene dei crimini.

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