Aspetti metodologici della Citometria a Flusso: un esperienza pratica

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1 Aspetti metodologici della Citometria a Flusso: un esperienza pratica Moris Cadei Università degli Studi di Brescia Riccione, 22 Maggio 2009

2 Biopsie gastriche Nel nostro Servizio Diagnosi istopatologica Colorazioni istochimiche Colorazioni immunoistochimiche

3 Ruolo del Patologo Grado di flogosi Attività infiammatoria Atrofia ghiandolare Metaplasia intestinale Helicobacter Pylori

4 Ruolo del Tecnico Alcian CD45 La metodica di routine per la valutazione della componente linfoide è l IIC

5 Human Pathology 1996 Gut 2001

6 Scand J Immun 2005

7 Materiale e Metodi 50 Pazienti sottoposti a gastroscopia nell Unità Chirurgica del P.O. di Montichiari (A.O. Brescia).

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9 Confronto tra metodiche L identificazione di antigeni espressi da una cellula, riconosciuti mediante reazione antigene-anticorpo.

10 Valutazione qualitativa Valutazione della positività Conta della positività su 10 campi a 40x

11 Valutazione quantitativa Valutazione della positività Analisi statistica

12 Immunoistochimica Panel anticorpale CD45 (LCA) CD 3 CD 20 CD 4 CD 8 CD 56 Antigen Retrival ottimizzato per ab

13 IIC-metodica 1. Sparaffinatura delle sezioni istologiche 2. Smascheramento antigenico 3. Metodica è stata eseguita seguendo il protocollo NovoLink Polymer Detection System : Peroxidase block Protein block Primary antibody Post primary block NovoLink polymer DAB

14 Citometria a Flusso CD45pc5 CD3fitc - CD19pe CD4fitc - CD8pe CD3fitc - CD56pe Ab coniugati con fluorocromi specifici

15 IFT-metodica 1. Disgregazione meccanica di microfrustolo in PBS 2. Filtrazione attraverso filtri di nylon (pori diametro 50 microm) in ghiaccio 3. Coniugazione con anticorpi specifici immunofluorescenti (FITC/PE) 4. Lettura citofluorimetrica con protocollo specifico 100 microlitri di sospensione + 10 microlitri di anticorpo

16 Protocollo di analisi al CF SS/CD 45+ CD 19+ CD 3+ Doppie/Triple marcature (LCA+T+B)

17 Risultati (diagnosi) 36/50 (72%) Gastrite cronica quiesciente 11/50 (22%) Gastrite cronica attiva 3/50 (6%) Mucosa normale CD 45 IIC Mucosa Normale Gatrite Cronica Quiesciente Gatrite Cronica Attiva

18 Diagnosi e linfociti (%) Immunoistochimica Citofluorimetria T B T B Gastrite cronica quiescente 61, ,6 16 Gastrite cronica attiva 47, ,5 32 Mucosa Normale

19 Risultati Confronto tra CF e IIC CF 40 IIC 20 0 CD45 CD3 CD19 CD4 CD8

20 Confronto metodologico CD 45 CONFRONTO TRA CD45 IIC E CD45 CF IIC 80 CF % casi Coefficiente di correlazione 0,97

21 Immunoistochimica vs Citofluorimetria Linfociti B CONFRONTO TRA CD20IIC E CD19CF CD19 IIC CD19 CF 40 Linfociti T CD3 IIC 60 CD3 CF CONFRONTO CD3IIC E CD3CF

22 Immunoistochimica CD 3 CD 20

23 Citofluorimetria CD45/SS 33% 70%

24 Citofluorimetria CD3/19 25% CD4/8 60% T>B 75% T8 > T4 40%

25 CONCLUSIONI 1 La tipizzazione delle popolazioni T e B mostra valori sovrapponibili con le due diverse metodiche. Analogo risultato è stato ottenuto per le sottoclassi CD4+ e CD8+. Il valore della Deviazione Standard (DS) nell analisi citofluorimetrica è più basso rispetto all immunoistochimica (più costante e quindi maggiormente affidabile?).

26 CONCLUSIONI 2 La differenza tra i due parametri per la popolazione linfoide (citofluorimetria mostra valori mediamente più bassi) può essere motivata: - dall anticorpo CD45 utilizzato (clone anticorpale diverso nelle due analisi). L anticorpo utilizzato per la metodica IIC è il PD 7/26 mentre quello utilizzato per la metodica citofluorimetrica è il J33; - dal gate individuato per la popolazione linfoide (perdita di elementi linfoidi).

27 Vantaggi e Svantaggi La citofluorimetria permette di ottenere un risultato quantitativo in tempi brevi e consente le doppie/triple marcature sullo stesso campione (risparmio di reagenti); Non è possibile la valutazione della morfologia. Il materiale deve essere inviato a fresco o in medium. La immunoistochimica può essere effettuata sul campione fissato in formalina ed incluso in paraffina dal Patologo che ha una visione del preparato al microscopio. Tempi più lunghi di processazione con una quantificazione indaginosa.

28 Prospettive future Mantenere viva questa metodica con applicazioni che possano offrire un dato quantitativo utile e soprattutto riproducibile: lo studio dell apoptosi in cellule in coltura (Istituto di Biochimica dell Università di Brescia); conta cellulare su tamponi per l esecuzione del pap-test (collaborazione con una azienda bresciana).

29 Ringraziamenti Colleghe del settore immunoistochimica (Anna, Lucia e Tiziana) Prof. Piergiovanni Grigolato A tutti voi per l attenzione