Dr.ssa Francesca Ciampini. ISVEA - Le tecniche analitiche di monitoraggio del Brettanomyces

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1 Le Tecniche Analitiche di monitoraggio del Brettanomyces Dr.ssa Francesca Ciampini

2 Brettanomyces sp. La scoperta e le prime classificazioni dalle fermentazioni secondarie della birra (N.H. Claussen 1904). B. bruxellensis e B. anomalus. Al microscopio si presentano forme polimorfiche. La presenza sia di cellule vitali che quiescenti di dimensioni molto ridotte ha fatto supporre che Brettanomyces riesca a superare anche la filtrazione sterile.(?)

3 Difetti organolettici prodotti da Brettanomyces sp. I difetti organolettici sono riconducibili a descrittori quali: Panno bagnato Urina di topo Sudore di cavallo/ Stalla Vernice/ plastica Usualmente tali difetti sono definiti come Nota Brett. Brettanomyces produce tutta una serie di composti definiti come fenoli volatili tra i quali troviamo: Il 4-EtilFenolo Il 4-EtilGuaiacolo

4 Fattori di rischio connessi alle strutture di cantina Condizioni igieniche: Superfici, Nastri trasportatori, Carrelli, Pompe, Tubi, ecc. Impiego di contenitori in legno: Botti/Barriques Pulizia delle Vasche in Cemento, Acciaio Coadiuvanti (chips)??

5 Fattori di rischio specifici connessi alle superfici in legno (Botti e Barriques)

6 Fattori di rischio connessi all attività Enologica Uve con specifici problemi sanitari (Botrite, etc.) Problemi di arresti o rallentamenti di fermentazione Alcolica (FA) Problemi di arresti o rallentamenti di fermentazione Malolattica (FML) Problemi di Brettanomyces in cantina Carenza di controlli dei Vini in Elevage Verifica dei Vini da impiegare per taglio Condizioni di conservazione dei vini in stoccaggio Valutazione dei possibili rischi dopo l imbottigliamento

7 Metodi di indagine per la ricerca e la quantificazione di Brettanomyces

8 Ricerca di Brettanomyces su Uve

9 Preparazione del campione di uva per la ricerca di Brettanomyces Prelevare un campione di almeno 2.5 Kg di uva, campionando acini interi, in punti diversi, in maniera casuale, da tutta la vigna. Conferire l uva all interno di sacchetti di plastica puliti (buste per freezer) Inviare il campione refrigerato al laboratorio di analisi

10 Tamponi ambientali da impiegare in cantina Tamponi da impiegare in punti difficili Tamponi da impiegare sulle superfici delle vasche ispezionabili (botti e vasche in cemento) Tamponi da impiegare per il recupero del Brettanomyces nelle barriques (Enoforum 2007)

11 Modalità di impiego dei tamponi ambientali Contattare il laboratorio per prenotare il numero di tamponi necessari per i controlli (almeno 1 settimana prima). Impiegare gli appositi tamponi contenenti il terreno di trasporto secondo quanto riportato nelle procedure di campionamento fornito dal laboratorio. Inviare il tampone refrigerato al laboratorio di analisi.

12 Preparazione del campione di vino Omogeneizzare la massa di vino prima di prelevare il campione (evitare il passaggio da rubinetti/assaggiavini) Prelevare circa 500 ml di campione in bottiglie sterili ( o in vetro dopo bollitura). Tappare la bottiglia preferibilmente con tappo sintetico Inviare al laboratorio per l analisi a temperatura ambiente

13 Sviluppo di Brettanomyces sp. e controlli microbiologici su vino

14 Scelta della tipologia di analisi Ricerca Lievito Brettanomyces sp. Metodo microbiologico di indagine classico attraverso analisi su terreno di coltura selettivo. Valutazione Rapida Brettanomyces sp. PCR-RT Metodo di indagine attraverso analisi di Biologia Molecolare sul DNA Quali/Quantitativo

15 Non solo analisi microbiologiche Controllo Chimico specifico Ricerca di Marcatori Chimici (Fenoli volatili) Controllo Chimico aspecifico Controllo dell Acidità Volatile Controllo Periodico dell Anidride Solforosa Controllo Sensoriale Saggi organolettici frequenti

16 Brettanomyces sp. attraverso terreni di coltura selettivi Tempo 0 7 giorni 10 giorni Crescita lenta Colonie gialle, verde oliva Agar Blu Giallo Odore fenolico

17 Quando eseguire il controllo su piastra Controlli sulle Uve Controlli con Tamponi Controlli dopo trattamenti Controlli sui vini in elevage Controlli sui vini dopo l imbottigliamento

18 Brettanomyces RT-PCR Analisi disponibile entro 48 ore dall arrivo del campione

19 Real-Time PCR La Real Time PCR permette di identificare e quantificare Brettanomyces attraverso la sua impronta genomica Metodo sensibile e fornisce risultati altamente riproducibili ed affidabili in tempi brevissimi. Vengono rilevati anche i microrganismi vitali ma non coltivabili (non rilevabili mediante tecniche di coltivazione su piastra) Brettanomyces (bruxellensis e anomalus)

20 Quando eseguire il controllo per PCR-RT Controlli a fine fermentazione alcolica (FA) Controlli durante la fase di Fermentazione Malolattica (FML) su singolo contenitore (barriques) Controlli sui vini solfitati Controlli sui vini in stoccaggio Controlli sui vini da taglio Il controllo ripetuto nel tempo assicura una migliore interpretazione del fenomeno

21 ...e dopo l imbottigliamento? Verifica microbiologica del livello di sterilità dei vini dopo microfiltrazione Verifica microbiologica della contaminazione residua nei vini non microfiltrati Verifica di tutte le condizioni di processo (Imbottigliamento conto terzi) Evitare di fare la PCR-RT solo come controllo finale

22 Modalità operative Isvea Analisi e Emissione Rapporti di Prova Problematiche Aziendali Ritiro Campioni in Azienda Consulenza Tecnico-Analitica e Protocolli di Campionamento

23 Team ISVEA - Sez. Microbiologia Staff Resp. Dr. Andrea Minacci a.minacci@isvea.it Dr.ssa Francesca Ciampini f.ciampini@isvea.it T.E. Lucia Bonelli l.bonelli@isvea.it Grazie per l attenzione