Prof. C. Mazzoni. Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie Agro- Industriali Università di Roma La Sapienza. Appunti della lezione 16 Capitolo 8

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1 MICROBIOLOGIA GENERALE Prof. C. Mazzoni Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie Agro- Industriali Università di Roma La Sapienza Appunti della lezione 16 Capitolo 8

2 REGOLAZIONE TRASCRIZIONE DELLA Negli eucarioti la regolazione trascrizionale di geni che codificano per proteine richiede l azione combinata di molte proteine che si collocano sulla regione del promotore del gene. Queste proteine si sommano alla RNA polimerasi II, e cadono in diverse classi quali proteine repressori ed attivatori, complessi coattivatori o corepressori, o, in modo più generalizzato, fattori di trascrizione. Molte di queste proteine sono conservate dal lievito ai mammiferi e quindi gli studi effettuati sul lievito Saccharomyces cerevisiae sono stati di grande utilità per la comprensione della trascrizione genica da parte della RNA polimerasi II. Organizzazione di un promotore di lievito Nel lievito sono presenti sia geni costitutivi che inducibili o reprimibili che, come negli altri eucarioti, vengono trascritti dalla RNA polimerasi II. Si può considerare, di maniera generale, che gli elementi di DNA che controllano la trascrizione dei geni negli eucarioti sono organizzati in moduli. Le regioni promotrici infatti sono composte di una serie di elementi funzionali distinti, ciascuno dei quali comprende uno o più siti di riconoscimento per dei fattori proteici specifici che agiscono in "trans". La diversità delle risposte regolatrici è assicurata dall' utilizzazione combinatoria di questi elementi e dalla loro interazione con i fattori di regolazione. I promotori di lievito contengono generalmente tre elementi di base: iniziatore, TATA e le regioni UAS organizzati come nello schema riportato nella Diap. 21. Gli elementi UAS (Upstream Activating Sequence) sono delle sequenze attivatrici della trascrizione. La natura, il numero e la posizione di tali sequenze e il loro effetto sul livello della trascrizione è variabile da un promotore ad un altro. Analogamente egli enhancer degli eucarioti superiori, le UAS possono agire a grandi distanze e sono funzionalmente attive nei due orientamenti. Contrariamente agli enhancer comunque, le UAS sono incapaci di attivare la trascrizione se poste a valle del gene. Le sequenze URS (Upstream Repressine Sequence) rappresentano possibili siti di legame di repressori e hanno un ruolo nella repressione dell attività trascrizionale. L' elemento TATA (TATA box) ed il sito di inizio della trascrizione rappresentano il sito di interazione con la RNA polimerasi con i suoi fattori che costituiscono il complesso generale di trascrizione dei geni eucariotici. I promotori di lievito possono contenere anche più di una sequenza TATA box e qualche volta né sono privi. Mentre negli eucarioti superiori il sito di inizio della trascrizione è determinato dalla posizione della TATA box e si trova circa nucleotidi a valle di questa, nel lievito la posizione di questi elementi, l' uno rispetto all' altro, è variabile (da 40 a 120 bp). Uno dei primi modelli per lo studio della regolazione genica è stato quello dell induzione in lievito dell espressione genica mediata da galattosio, che è sotto il controllo dell attivatore trascrizionale Gal4. Il regulone GAL

3 L espressione dei geni GAL è necessaria per la crescita su galattosio e comprendono I geni strutturali (GAL1, GAL7, GAL2 e GAL10) e geni regolatori (GAL4, GAL80 e GAL3). I prodotti dei geni GAL sono richiesti per il trasporto del galattosio nella cellula e la sua utilizzazione attraverso il pathway glicolitico. Il galattosio è traslocato dalla permeasi Gal2 e fosforilato dalla galattochinasi Gal1. Successivamente la galattotransferasi Gal7 trasferisce il gruppo UDP e l epimerasi Gal10 lo converte in UDP-glucosio, che verrà utilizzato nella via glicolitica. L induzione dei geni strutturali GAL dipende dall attivatore trascrizionale Gal4, che si lega in regioni UAS (UAS GAL ) presenti nei loro promotori. Il legame di Gal4 a più elementi UAS GAL è coopertivo e porta ad una attivazione sinergica della trascrizione. La sequenza UAS GAL è sufficiente per mediare l induzione da galattosio attraverso Gal4 anche quando viene inserita in un promotore eterologo. Questa proprietà è stata ampiamente utilizzata per la generazione di sistemi d espressione eterologhi inducibili. In assenza di galattosio Gal4 si trova sulla UAS GAL, ma non è in grado di attivare la trascrizione a causa della presenza della proteina Gal80 che maschera il dominio che attivatore della trascrizione di Gal4. In presenza di galattosio, Gal80 si dissocia da Gal4 che può esercitare la sua funzione di attivatore della trascrizione (Diap ). Gal4 è una proteina da 881 aminoacidi contenente un dominio in grado di legare il DNA, due domini di attivazione della trascrizione, un dominio per la dimerizzazione, un dominio linker e un sito di legame per Gal80 (diap. 28). Gli studi sul sistema di regolazione da galattosio in lievito hanno apportato un contributo fondamentale allo stato di conoscenza della regolazione della trascrizione. Questi studi hanno fornito un modello per la comprensione dei meccanismi di controllo della trascrizione anche in altri organismi. Inoltre, questi studi sono stati applicati per sviluppare regolatori della trascrizione artificiali e potranno essere eventualmente usati per la progettazione di droghe in grado di modulare gli apparati trascrizionali o per veicolare vie specifiche di espressione genica in vivo.

4 Scambio di domini e sistema del doppio ibrido I domini delle proteine con funzioni diverse continuano a mantenere inalterate le loro attività anche se vengono estrapolati dal loro contesto originale. Esperimenti di domain swap dimostrano infatti che i domini sono intercambiabili. Es. le proteine Gal4 di lievito e LexA di E. coli possiedono un dominio che lega il DNA (DBD= DNA binding domain) e un altro dominio che attiva la trascrizione (AD= activation domain). Nell esperimento mostrato nella diap. 30, il dominio DBD di LexA è stato fuso con il dominio AD di Gal4 a formare una proteina ibrida di origine batteriolievito. Si può inserire nel promotore del gene HIS3, che codifica per una proteina importante per la sintesi di istidina, il sito legato dal DBD di LexA. Questo ceppo non potrà crescere in assenza di istidina (autotrofo per istidina) in quanto nessun fattore di lievito riconosce il sito di legame di LexA e quindi la trascrizione non è attivata. L inserimento in questo ceppo della proteina ibrida DBDLexA/ADGal4 consentirà la trascrizione del gene HIS3: il DBDLexA viene legato al sito operatore e il dominio ADGal4 attiva la trascrizione del gene. Appurato che i domini sono intercambiabili, si è potuto mettere a punto il sistema del doppio ibrido, che viene usato per mettere in evidenza l interazione tra due proteine in vivo. La porzione di proteina tra i due domini può essere infatti sostituita da altre sequenze proteiche non correlate alla proteina. Nella diap 31 viene utilizzato lo stesso ceppo descritto nella diap. 30 (gene HIS3 sotto il controllo dell operatore riconosciuto dal DBDLexA). Il DBDLexA è stato fuso ad un gene X che codifica per una proteina che normalmente non lega il DNA e non attiva la trascrizione. La proteina chimerica che contiene questa fusione sarà in grado di legare il DNA allo stesso sito operatore del DBD originario, ma non potrà attivare la trascrizione (manca l AD). L ADGal4 è stato fuso ad un gene Y che codifica per una proteina che normalmente non lega il DNA e non attiva la trascrizione, ma la proteina chimerica è potenzialmente in grado di attivare la trascrizione. Se le proteine X e Y interagiscono, si otterrà la trascrizione del gene HIS3 a valle del promotore contenente il sito operatore per il sito di legame al DNA e il ceppo sarà in grado di crescere in assenza di istidina.

5 SISTEMI DI REGOLAZIONE A DUE COMPONENTI In che modo un batterio sente e risponde a specifici segnali provenienti dall ambiente? Per esempio, nel caso dell operone lac la presenza del lattosio nel terreno determina l attivazione dell espressione genica dell operone. Un altro tipo di regolazione è quello operato dall utilizzazione di fattori sigma alternativi che, insieme con altre proteine, regolano l attività dell RNA polimerasi e quindi modulano la trascrizione. Ma in che modo i le cellule batteriche sentono stimoli esterni come per esempio il ph, che non coinvolgono sostanze specifiche e in che modo questi stimoli sono convertiti in segnali interni? In natura, i batteri devono poter recepire e rispondere rapidamente a cambiamenti ambientali quali variazioni nella disponibilità di nutrienti, osmolarità, temperatura etc.. Per questo motivo si è evoluto un sistema piuttosto complesso che è in grado di sentire l esterno e ridirigere l espressione genica in risposta ai segnali percepiti. Questo meccanismo è noto come SISTEMA DI REGOLAZIONE A DUE COMPONENTI. Sono noti almeno 24 esempi di questo tipo di regolazione. Quali tipi di segnali esterni vengono riconosciuti? * Osmolarità * Fosfato * Zuccheri * Nitrato * Essudati di piante * Livelli di ossigeno * Livelli d azoto L organizzazione del sistema di regolazione a due componenti è conservata. Tutti i sistemi di regolazione a due componenti consistono di due componenti costituiti da due proteine. Il primo componente è un SENSORE- TRASMETTITORE che attraversa la membrana citoplasmatica. Questa proteina che attraversa tutta la membrana presenta due domini: il dominio esterno costituisce il sensore. E localizzato nello spazio periplasmatico ed è il dominio che riconosce specifici segnali esterni e quindi percepisce il segnale. Il secondo dominio è il dominio trasmettitore che è localizzato nel citoplasma. I due domini sono ancorati alla membrana citoplasmatica da due regioni che attraversano la membrana. Il trasmettitore è capace di autofosforilarsi utilizzando ATP. Durante questa reazione, un gruppo fosfato (PO 4 ) è trasferito ad uno specifico residuo di istidina (His) presente nella proteina. Il dominio trasmettitore contiene anche un attività chinasica che lo rende capace di trasferire il gruppo PO 4 ad un secondo componente ricevente-regolatore nel momento in cui viene rilevato il segnale ambientale. Il secondo componente è il RICEVENTE-REGOLATORE che è localizzato nel citoplasma. Anche questo componente è costituito da due domini. Il primo è un dominio ricevente che presenta un residuo di acido aspartico (Asp) che può accettare il gruppo fosfato trasferito dal dominio trasmettitore del primo componente. Il secondo dominio è il regolatore che, in risposta alla

6 presenza di un gruppo PO 4 legato al dominio ricevente, può legare a specifiche sequenze di DNA in specifici promotori e attivare l espressione genica. Questi due domini sono legati da un linker flessibile. Tali domini sono altamente conservati tra i sistemi di regolazione a due componenti identificati fino ad ora. Ciò è molto interessante in quanto ogni sistema è altamente specifico per un dato segnale e non ci sono sovrapposizioni tra diversi sistemi. Questo è un chiaro esempio conservazione evoluzionistica e, nello stesso tempo, di indipendenza funzionale. Un altro nome per questo tipo di regolazione genica è trasduzione del segnale poiché un segnale esterno alla cellula viene decodificato all interno della cellula. Il sistema a due componenti OmpR/EnvZ di E. coli Per osmolarità si intende la quantità di soluti in soluzione. Più alta è òla quantità di soluti (fonti di carbonio, sali, ioni etc.), più è alta l osmolarità.. La parete cellulare di E. coli è composta dalla membrana esterna che insieme alla membrana citoplasmatica avvolge lo spazio periplasmatico contenente lo strato di peptidoglicano. La membrana citoplasmatica è la principale barriera di permeabilità, ma non può sostenere un gradiente di pressione. La membrana esterna invece esclude le macromolecole, ma contiene numerosi pori che permettono l ingresso per diffusione di piccole molecole idrofiliche anioniche nello spazio periplasmatico. In questo modo viene mantenuta la pressione osmotica tra il periplasma ed il citoplasma. Le due porine principali sono OmpF e OmpC, codificate rispettivamente dai geni strutturali OmpF e OmpC. Queste proteine formano dei canali, o pori, nella membrana esterna che consentono il passaggio di molecole con diversa taglia. Ogni canale è formato da tre subunità di porina e OmpF forma dei pori leggermente più grandi rispetto a quelli formati da OmpC. Sebbene il numero di pori rimanga costante nella membrana esterna, il rapporto tra i pori formati da OmpF e OmpC cambia in risposta al grado di osmolarità del terreno che circonda la cellula. * Alta osmolarità: predomina OmpC * Bassa osmolarità: predomina OmpF Es. nell intestino, dove l osmolarità e la temperatura sono elevate, predomina OmpC. In questo modo la cellula si protegge dall ngresso dei sali biliari che sono tossici. Al di fuori dell intestino, l osmolarità e la temperatura sono più basse. In questa situazione predomina OmpF che consente l ingresso nella cellula di un maggior numero di nutrienti. Regolazione dell espressione genica di ompf e ompc in risposta a cambiamenti osmotici In E. coli il pathway di trasduzione consiste di due proteine EnvZ (sensoretransmettitore) e OmpR (receventeregolatore). OmpC è localizzato a 48 minuti sulla mappa di E. coli mentre OmpF è localizzato a 21 minuti, indicando che i 2 geni non sono vicini. Comunque, le regioni del promotore di entrambe i geni

7 contengono siti di legame per OmpR nella sua forma fosforilata (OmpR in quanto ricevente-regolatore può agire come attivatore della trascrizione solo quando è fosforilato). Il segreto della regolazione risiede nel numero di siti e nell affinità che questi presentano per OmpR-fosforilato. Nel promotore di OmpC sono presenti tre siti a bassa affinità per OmpR (C1, C2 e C3). Al contrario, nel promotore di OmpF sono presenti due siti a bassa affinità (F3 e F4) e due siti ad alta affinità (F1 e F2) per OmpR. Bassa osmolarità In condizione di bassa affinità, nessun segnale è percepito da EnvZ e quindi OmpR non viene fosforilato (attivato). In ogni caso, nella cellula ci sono sempre alcune molecole di OmpR fosforilate, anche in condizioni di bassa osmolarità; queste poche molecole saranno catturate dai due siti ad alta affinità (F1 e F2) presenti nel promotore di OmpF, determinando l espressione del gene ompf. Il risultato sarà un incremento di pori più grandi, formati da OmpF, che permetteranno il passaggio nello spazio periplasmatico di più molecole. Alta osmolarità In condizioni di alta osmolarità, le alte concentrazioni di soluto sono percepite da EnvZ con conseguente fosforilazione di molte proteine OmpR nel citoplasma. A questo punto, l incremento di OmpR fosforilato determina due eventi: quindi la proteina OmpF. OmpR, infatti, è un regolatore della trascrizione che può agire sia da attivatore che da repressore. (Questa caratteristica è comune a molte proteine che legano il DNA). Infatti, si crea una struttura che rende il promotore inaccessibile all RNA polimerasi (diap. 39). 2. OmpR si lega ai tre siti a bassa affinità presenti sul promotore del gene ompc attivandone la trascrizione. In queste condizioni infatti compaiono i pori piccoli formati dalla porina OmpC. Riassunto: La quantità della proteina OmpR fosforilata nella cellula determina quale proteina tra OmpF e OmpC viene prevalentemente espressa. La quantità di OmpR fosforilata è determinata dalla percezione della pressione osmotica da parte di EnvZ. 1. OmpR di lega non soltanto ai siti ad alta affinità presenti nel promotore di OmpF, ma anche ai siti a bassa affinità (F3 e F4) presenti nello stesso promotore. Quando OmpR è legato a questi siti a bassa affinità nel promotore di OmpF funziona da repressore e

8 REGOLAZIONE ANTISENSO Gli RNA antisenso sono piccole molecole di RNA non tradotte che si appaiano a regioni complementari di specifici mrna bersaglio (target). Questo appaiamento determina il cambiamento nell espressione o nella funzione del mrna bersaglio a livello post-trascrizionale. La presenza di RNA antisenso è ben documentata nei procarioti, principalmente nei plasmidi e nei batteriofagi. Inoltre, svolgono un ruolo importante nella regolazione genica sia nei procarioti che negli eucarioti. Gli RNA antisenso contengono molte strutture a forcina (stem-loop: stelo con ansa). I domini presenti nell ansa (loop) sono importanti per la specificità del target mentre le strutture dello stelo (stem) sono coinvolte nella stabilità dell RNA. Gli RNA antisenso sono sintetizzati in due modi differenti: 1) Tramite la trascrizione opposta all interno di un gene. Per definizione, la trascrizione di una della doppia elica di DNA sarà 100% complementare al prodotto della trascrizione dell elica opposta. 2) Tramite la trascrizione di una regione non correlata del genoma. In questo caso la sequenza dell RNA antisenso è normalmente complementare alla sequenza target con qualche errore (meno del 100% di complementarietà). Ciò è dovuto al fatto che le due regioni trascritte sono distinte e non c è una selezione per mantenere la complementarietà. Il controllo mediato dall RNA antisenso riguarda le più disparate funzioni biologiche e include la replicazione del DNA plasmidico, la trasposizione, lo sviluppo di batteriofagi e l espressione di specifici geni batterici. Controllo del livello di proteina OmpF Abbiamo precedentemente discusso la regolazione dell espressione genica delle porine ompf e ompc in E. coli attraverso il sistema di regolazione a due componenti EnvZ/OmpR. In questo sistema a due componenti EnvZ e OmpR determinano l espressione di ompf e ompc a seconda della osmolarità dell ambiente circostante. In ogni caso, la cellula ha la necessità di variare la quantità di OmpF nella membrana esterna in risposta ad altri stimoli ambientali quali la presenza di antibiotici specifici ed in risposta a variazioni di temperatura. Il sistema EnvZ/OmpR non risponde a questi segnali quindi, E. coli ha evoluto un altro meccanismo per regolare i livelli di porina OmpF. E. coli contiene un gene, chiamato micf, che codifica per un RNA non tradotto lungo 93 nt (MicF). micf (49.8 ) è fisicamente distante da ompf, ma è localizzato vicino a ompc (49.7 ). MicF è complementare al mrna di ompf al 70%, si può comunque appaiare all estremità 5 del mrna ompf e questo appaiamento impedisce il legame del ribosoma al codone d inizio AUG. In questo modo, MicF inibisce l inizio della traduzione del mrna di ompf mascherando i siti di riconoscimento da parte del ribosoma (diap. 43). MicF non ha un ruolo nell espressione di ompf in risposta a cambiamenti di osmolarità in quanto una delezione di micf non determina cambiamenti sulla quantità di OmpF prodotta in queste condizioni. Tuttavia, ha effetto su altri stimoli ambientali quali: 1. temperature elevate

9 2. esposizione al salicilato 3. stress ossidativo Tutte queste condizioni riducono i livelli di ompf tramite la regolazione da parte dell RNA antisenso prodotto da MicF. Inoltre, MicF è anche parzialmente responsabile per gli effetti osservati in: 1. mutanti tolc (resistenti al toluene) 2. mutanti marc (resistenza multipla agli antibiotici) 3. resistanza ai macrofagi E perciò evidente che MicF è coinvolto nella difesa cellulare contro molecole tossiche esterne tramite la riduzione delle porine OmpF sulla membrana esterna.