Influenza della modalità di conservazione su bottarga di muggine

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1 bottarga P. Scano 1 * - S. Mereu 1 - A. Rosa 2 1 Dipartimento di Scienze Chimiche e Geologiche, Università di Cagliari - Cittadella Universitaria di Monserrato Monserrato - CA - Italia 2 Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Cagliari - Cittadella Universitaria di Monserrato Monserrato - CA - Italia * scano@unica.it Influenza della modalità di conservazione su bottarga di muggine Effect of storage conditions on mullet bottarga INTRODUZIONE Bottarga è il nome italiano del prodotto salato ed essiccato di uova di pesce, tra i quali muggine, tonno e molva. Fra le tipologie di bottarga, quella di muggine (Mugil cephalus) sta guadagnando un notevole interesse nel mercato alimentare sia nazionale che internazionale come prelibatezza per antipasti o come condimento per spaghetti e pasta. È apprezzata per le sue qualità sensoriali: ha un colore ambrato, al tatto è soda e compatta e presenta un sapore intenso e amarognolo. La Sardegna vanta un antica tradizione per la produzione di bottarga di muggine di qualità, con elevati livelli di acidi grassi n-3, benefici per la salute (Scano et al., 2008), infatti essa è annoverata tra i prodotti tipici della regione Sardegna (art. 8 Decreto Legislativo n. 173/98, Decreto Ministeriale n. 350/99) e le metodiche di lavorazione, conservazione e stagionatura sono descritte nel sito della regione Sardegna. In Sardegna Parole chiave bottarga di muggine, metaboliti, 1 H NMR, degradazione Key words mullet bottarga, metabolites, 1 H NMR, degradation SOMMARIO In questo lavoro sono state studiate le modifiche a carico dei metaboliti della frazione acquosa di campioni di bottarga di muggine, indotte da diverse modalità di conservazione. Questo pool molecolare comprende aminoacidi liberi, acidi organici, nucleotidi e derivati, zuccheri, ammine volatili ed altri. La tecnica di indagine utilizzata è la Spettroscopia 1H NMR allo stato liquido. La bottarga e stata conservata a -20 C, a 4 C, a temperatura ambiente al buio e alla luce per 7 mesi. I campioni sono stati analizzati al tempo 0 e dopo 1, 2, 3, 5 e 7 mesi. I risultati dell analisi multivariata PCA applicata ai dati spettrali mostrano che i campioni conservati a -20 C ed analizzati a diversi tempi non differiscono in maniera sostanziale e che il loro profilo presenta caratteristiche opposte a quelli conservati per 5 e 7 mesi a temperatura ambiente, buio e luce. Inoltre, l analisi delle aree integrate degli spettri dei campioni indica che nel tempo le maggiori modifiche composizionali sono: l aumento dei derivati del breakdown della fosfatidilcolina (colina, fosfocolina, glicerolo), la rottura dei nucleosidi, la diminuzione di alcuni aminoacidi, quali metionina, triptofano, tirosina, e della creatina. Queste modifiche sono state osservate in tutte le modalità di conservazione ma con andamenti più marcati nei campioni a temperatura ambiente. SUMMARY The paper shows the modifications of the water-soluble low molecular weight metabolites extracted from samples of salted and dried mullet roe stored at different temperatures. This molecular pool comprises free amino acids, organic acids, nucleotides and derivatives, sugars, volatile amines and others. The survey technique used is the 1H NMR spectroscopy in the liquid state. The roes were stored at -20 C, at 4 C, and at room temperature in dark and light exposure, for 7 months. The samples were examined at initial time and after 1, 2, 3, 5 and 7 months of storage. The multivariate analysis PCA applied to the spectral data indicated that samples stored at -20 C are very similar during time and exhibit opposite characteristics to those stored for 5 and 7 months at room temperature, darkness and light. The analysis of the integrated areas of the spectra indicated that the major compositional changes are: the increase of the derivatives of the breakdown of phosphatidylcholine (choline, phosphocholine, glycerol), the breakdown of nucleosides, the decrease of some amino acids such as methionine, tryptophan, tyrosine, and of the creatine. These changes were observed at all storage conditions but with more pronounced trends in the samples at room temperature 10 - INGREDIENTI ALIMENTARI - XIII (2014) aprile

2 BOTTARGA vengono lavorate ogni anno circa 200 tonnellate di bottarga di cui solamente 1-2 tonnellate provengono da muggini pescati nell isola e sono destinate ad un mercato di nicchia. La bottarga è venduta come ovaio intero ( in baffe ), con le membrane intatte, sigillato sottovuoto, oppure grattugiata in barattoli di vetro o in sacchetti di plastica. Anche se salatura ed essiccamento sono efficaci strategie di conservazione degli alimenti, conosciute fin dall antichità, esse non possono evitare il deterioramento delle matrici alimentari. Pertanto una più profonda conoscenza delle modificazioni chimiche a cui va incontro la bottarga durante la shelf life potrebbe certamente migliorare le tecniche di produzione e i protocolli di imballaggio e conservazione. Nello studio della stabilità dei prodotti ittici molte ricerche sono state dedicate allo studio della frazione lipidica per il suo contenuto di acidi grassi n-3, e per l elevata suscettibilità all ossidazione di questi componenti molecolari che hanno fino a sei doppi legami (Kolanowski et al., 2007). Oltre ad idrolisi ed ossidazione dei lipidi, vi sono altre importanti modifiche a carico dei componenti molecolari che hanno luogo nelle fasi di produzione e durante la shelf life, queste si riflettono, oltre che sulle qualità nutrizionali, anche su quelle sensoriali. Infatti la bottarga, anche confezionata, tende ad assumere un colore scuro, accompagnato da modifiche della consistenza e del sapore (dati empirici). Alcune ricerche (Doe et al., 1998) imputano il fenomeno dell imbrunimento nelle uova di muggine essiccate ad una serie di reazioni tra ammine, aminoacidi, peptidi e proteine con zuccheri riducenti e lipidi ossidati (reazione di Maillard ed interazione proteina-lipide). Un pool molecolare molto interessante, in grado di rispecchiare eventuali modifiche della matrice originale di questo prodotto, è quello composto da metaboliti a basso peso molecolare dispersi in fase acquosa. Questo pool è composto da diversi intermedi dei pathway metabolici, da prodotti dei processi di ossidazione e di rottura di macromolecole quali triacilgliceroli, fosfolipidi, acidi nucleici, proteine, polisaccaridi, etc. (Chiou et al. 1988). È utile ricordare che alcuni di questi componenti molecolari partecipano anche alla definizione del sapore, del colore e dell odore di un alimento (Fuke et al. 1991; Hayashi et al. 1990). Alla luce delle considerazioni sopra riportate, lo scopo di questo lavoro è quello di studiare, mediante la spettroscopia 1 H NMR e l analisi dei componenti principali (PCA), le modificazioni nel tempo dei componenti idrosolubili di campioni di bottarga mantenuti a diverse condizioni di conservazione. La spettroscopia 1 H NMR ha il vantaggio di non richiedere una estensiva manipolazione chimico-fisica del campione, evitando così la perdita di componenti molecolari, e, non essendo selettiva, consente la rilevazione contemporanea di tutte le sostanze presenti nel campione. Inoltre, questa tecnica consente un analisi rapida di miscele complesse grazie all alta suscettibilità NMR e all abbondanza naturale di questo isotopo. L applicazione delle tecniche statistiche multivariate (quali la PCA) ai dati ottenuti da spettri 1 H NMR di miscele complesse, come quelle del pool di metaboliti idrosolubili, permette di individuare, all interno della struttura dei dati, la presenza di cluster o di trend caratteristici, di identificare outlier, di valutare il ruolo delle variabili nella caratterizzazione dei campioni e altre informazioni non altrimenti evidenziabili. Materiali e Metodi Campioni La bottarga di muggine grattugiata è stato gentilmente fornita, immediatamente dopo la manifattura, dalla ditta Stefano Rocca srl con sede in Sardegna (Italia). Gli ingredienti riportati in etichetta erano: uova di muggine e sale marino. Il campione bottarga è stato suddiviso in aliquote e queste sono state conservate per 7 mesi in barattoli chiusi a -20, a 4 C ed a temperatura ambiente alla luce e al buio. A tempi diversi (controllo, 1, 2, 3, 5 e 7 mesi) sono stati effettuati dei prelievi per l analisi. Estrazione I componenti idrosolubili sono stati estratti dai campioni di bottarga utilizzando una soluzione di CHCl 3 / MeOH/H 2 O (2/1/1 v/v/v) secondo la metodica Folch (Folch et al., 1957). Brevemente, a 60 mg di campione sono stati aggiunti dapprima 12 ml di CHCl 3 /MeOH e dopo un ora, al fine di solubilizzare i componenti idrofilici, 4 ml di H 2 O. Dopo centrifugazione a 900 g per 1 h, la miscela MeOH/H 2 O, contenente i componenti idrosolubili è stata separata dalla frazione CHCl 3 e portata a secco con un evaporatore rotante, infine è stata ridisciolta in D 2 O per l analisi NMR. Esperimenti NMR Gli esperimenti 1 H NMR sono stati effettuati con uno spettrometro Varian 400 INOVA operativo a MHz. INGREDIENTI ALIMENTARI - XIII (2014) aprile - 11

3 bottarga Gli spettri sono stati registrati a 25 C con una larghezza spettrale di Hz, un impulso a 90, un tempo di acquisizione di 3 s, un ritardo di 20 s e 64 scansioni. Il segnale di acqua residua è stato soppresso mediante l applicazione di una tecnica di presaturazione con radiofrequenza a bassa potenza per 1.5 s. Gli spostamenti chimici sono riferiti alla risonanza del TSP posto a 0.00 ppm. Gli spettri 2D NMR 1 H- 1 H COSY sono stati acquisiti con un ampiezza spettrale di 4423 Hz in entrambe le dimensioni, data points e 512 incrementi con 48 transienti per incremento. L assegnazione dei segnali ai diversi metaboliti è stata effettuata basandosi sui dati riportati in letteratura (Fan, 1996; Seierstad et al., 2008), comparando gli spettri con quelli dei composti standard e aggiungendo il composto alla miscela in esame e ri-registrando lo spettro nelle stesse condizioni. Risultati e discussione Lo spettro 1 H NMR dei componenti idrosolubili estratti dalla bottarga mostra un centinaio di risonanze dovute ai diversi gruppi funzionali dei composti chimici presenti in questa frazione, e appare come una impronta digitale del campione. In Fig. 1 sono riportati gli spettri, con Pretrattamento dei dati spettrali e analisi statistica Lo spettro (8,50-0,80 ppm) è stato ridotto in piccoli intervalli (bin) di 0,04 ppm di ampiezza (procedura di bucketing). Per eliminare gli effetti della procedura di presaturazione dell acqua, la regione spettrale tra 4,54 e 5,10 ppm è stata eliminata dall analisi statistica. Per l elaborazione del FID, l analisi degli spettri e le procedure di bucketing è stato utilizzato il programma MestReNova. La matrice risultante (25 x 175) in cui le righe sono i campioni e le colonne i dati spettrali (bin) è stata importata nel programma SIMCA-P+ e sottoposta ad analisi statistica multivariata PCA, previa applicazione della procedura di autoscaling. Fig. 1 - Spettri 1 H NMR della frazione acquosa estratta in diversi tempi da campioni di bottarga conservata a temperatura ambiente; intervalli spettrali: a) 0,5-4,3 ppm; b) 5,1-8,5 ppm. Sono riportate le maggiori attribuzioni INGREDIENTI ALIMENTARI - XIII (2014) aprile

4 BOTTARGA le principali attribuzioni, dei campioni prelevati in tempi diversi dalla bottarga conservata a temperatura ambiente. Tra i metaboliti identificati vi sono aminoacidi liberi, acidi organici, nucleotidi e derivati, zuccheri semplici, ammine volatili ed altri. Dall analisi comparativa degli spettri in Fig. 1 si possono vedere delle graduali modifiche spettrali, anche se il profilo complessivo non appare mutato. Considerata la loro complessità, gli spettri sono stati sottoposti alla procedura di bucketing e i dati risultanti elaborati tramite la tecnica multivariata PCA. In Fig. 2 sono riportati i campioni proiettati nello spazio individuato dalle prime 2 componenti (scores plot), qui si può vedere che i campioni conservati a -20 C ed il campione lasciato per un mese a 4 C, formano un gruppo a destra del plot, ciò indica che esistono forti similitudini tra loro. Lungo la PC1, dalla parte opposta del plot, quindi con caratteristiche opposte, si può osservare un altro raggruppamento formato dai campioni tenuti per 5 e 7 mesi a temperatura ambiente (luce e buio). Gli altri campioni sono dispersi nel plot. Questi risultati indicano che nel tempo la bottarga conservata a -20 C non va incontro a modifiche tali da riflettersi negli spettri 1 H NMR della frazione acquosa, questi campioni sono quindi simili al controllo (T0), così come il campione conservato per 1 mese a 4 C. Le modifiche maggiori avvengono ai 5 e 7 mesi nei campioni conservati a temperatura ambiente, senza evidenti differenze fra quelli esposti alla luce e quelli tenuti la buio. Ai fini di questo lavoro, teso ad individuare quei componenti molecolari maggiormente coinvolti dalle modalità di conservazione, sono state misurate e confrontate le intensità relative di alcuni segnali NMR, attribuiti a diversi metaboliti, degli spettri di campioni prelevati a tempi diversi. Come si può evincere dall analisi della Fig. 2 e dopo un attenta analisi degli spettri, è stato deciso di non riportare i dati relativi ai campioni conservati a -20 C poiché presentavano nel tempo minime modifiche spettrali; sono invece riportati i dati inerenti i campioni conservati a 4 C e a temperatura ambiente. Temperature che trovano più facilmente corrispondenza con quelle di conservazione casalinghe e/o dei rivenditori al dettaglio. In Fig. 3 sono riportati gli andamenti nel tempo di alcuni componenti molecolari. In particolare le Figg. 3a e 3b, inerenti gli andamenti del glicerolo, della colina e della fosfocolina, mostrano il sensibile aumento della concentrazione di colina e glicerolo, mentre la fosfocolina rimane stabile. È da notare come l andamento sia più marcato nei campioni a temperatura ambiente. Questi tre composti molecolari con alta probabilità derivano dalla rottura, preceduta probabilmente da idrolisi, delle molecole di fosfatidilcolina, di cui la bottarga è ricca (Scano et al., 2008). Nelle Figg. 3c e 3d sono mostrati i dati inerenti i ribonucleosidi, le purine e le pirimidine (uracile e citosina). La concentrazione delle basi azotate non varia sensibilmente ad entrambe le temperature. Per quanto riguarda le purine vi è un apparente contrasto fra questi risultati e le modifiche spettrali visibili in figura 1b, probabilmente le purine tendono a trasformarsi (inosina ipoxantina xantina; adenosina adenina etc), dando quindi origine a frequenza Fig. 2 - PCA scores plot dei dati spettrali 1 H NMR degli estratti acquosi di campioni di bottarga conservati a diverse modalità. Legenda: * -20 C, 4 C, temperatura ambiente al buio, temperatura ambiente alla luce. 1m, 2m, 3m, 5m, 7m: mesi di conservazione. T0 campione al tempo 0. INGREDIENTI ALIMENTARI - XIII (2014) aprile - 13

5 bottarga NMR leggermente shiftate, pur mantenendo una concentrazione totale costante nel tempo. Inoltre, in Fig. 3d (campioni conservati a temperatura ambiente) possiamo osservare una drastica diminuzione dei nucleosidi, con conseguente rilascio del ribosio, poiché quest ultimo è stato trovato solo in tracce negli spettri è possibile che, appena liberato, venga immediatamente coinvolto in reazioni di imbrunimento non enzimatico (Omura et al. 2004). Nelle Figg. 3e e 3f sono riportati gli andamenti di alcuni aminoacidi: a 4 C già dal terzo/quinto mese di conservazione Fig. 3 - Variazioni della concentrazione % di alcuni componenti molecolari idrosolubili estratti da campioni di bottarga conservati a diverse modalità: campioni conservati a 4 C a), c), e); e a temperatura ambiente b), d), f). la tirosina e la metionina diminuiscono del 50%, mentre a temperatura ambiente si può osservare una drastica diminuzione (-80%) della metionina ma anche del triptofano. Poiché è stato riportato che questi tre aminoacidi sono altamente suscettibili a fenomeni ossidativi (Finley et al. 1998; Shacter), le diminuzioni osservate potrebbero essere dovute a fenomeni degradativi a carico del materiale proteico, infatti marcati fenomeni ossidativi a carico delle proteine sono stati osservati in diversi prodotti ittici (Castrillon et al., 1996; Wesselinova 2000.). Diversi studi riportano (Castrillon et al., 1996; Wesselinova 2000) che la metionina ossidandosi dà origine al suo derivato sulfossido; un attenta analisi degli spettri 1 H NMR mono e bi-dimensionali dei campioni a 5 e 7 mesi di conservazione ha permesso l identificazione della molecola di metionina-sulfossido il cui aumento di concentrazione relativa è inversamente correlato alla diminuzione del suo precursore (dati non mostrati). In Fig. 4a sono riportati gli andamenti in funzione del tempo della creatina a 4 C e a temperatura ambiente. Come si può vedere, la sua concentrazione diminuisce fino ad arrivare ad un valore costante a partire dal 3 mese di conservazione; la creatina tende a chiudersi ad anello formando la creatinina, segnali attribuiti a questo composto sono stati identificati negli spettri 1 H NMR di campioni conservati per oltre 3 mesi, purtroppo a causa di forti sovrapposizioni di risonanze non è stato possibile misurarne la concentrazione relativa. In Fig. 4b sono riportati gli andamenti della trimetilammina (TMA), ad entrambe le temperature di conservazione si può osservare un sensibile aumento al 14 - INGREDIENTI ALIMENTARI - XIII (2014) aprile

6 BOTTARGA Fig. 4 - Variazioni della concentrazione % di alcuni componenti molecolari idrosolubili estratti da campioni di bottarga conservati a 4 C e a temperatura ambiente (room). 1 mese, poi una diminuzione e una tendenza ad aumentare dal 5 mese. Questa molecola volatile, dal forte odore sgradevole, è usata come biomarker di degradazione in prodotti ittici (Martinez et al. 2005), essa deriva dalla degradazione del TMAO (ossido della trimetilammina) di cui sono ricchi i prodotti ittici. L andamento non lineare riportato in Fig. 4b potrebbe essere dovuto a diversi fattori: la TMA è il prodotto di attività batterica ed è stato riportato che la bottarga ha una bassa carica batterica rappresentata prevalentemente da alofili (Coroneo et al., 2009), inoltre la bottarga non è particolarmente ricca di TMAO (non quanto il tessuto muscolare dei pesci), quindi la produzione di TMA dovrebbe essere limitata, inoltre la sua elevata volatilità potrebbe determinarne una perdita durante la conservazione e nelle fasi di estrazione. In conclusione, alla luce di questi risultati, si può affermare che l analisi NMR del pool molecolare estratto dalla frazione acquosa della bottarga è in grado di fornire informazioni sulle modifiche composizionali che avvengono nel tempo a diverse modalità di conservazione. Le maggiori modifiche riguardano processi idrolitici dei fosfolipidi, ciclizzazione della creatina, fenomeni ossidativi a carico degli aminoacidi, rottura del legame ribosio-base azotata ed aumento del TMA. Gli andamenti osservati tendono ad essere più marcati nei campioni conservati a temperatura ambiente. RINGRAZIAMENTI Si ringrazia l azienda Stefano Rocca s.r.l. per aver fornito i campioni. Ricevuto il 15 giugno 2011 BIBLIOGRAFIA - Castrillón A.M., Alvarez-Pontes E., Arias M.T.G. and Navarro P. Influence of Frozen Storage and Defrosting on the Chemical and Nutritional Quality of Sardine (Clupea pilchardus). Journal of the Science of Food and Agriculture, 70, 29-34, Chiou T.K., Konosu S. Changes in Extractive Components during Processing of Dried Mullet Roe. Nippon Sui san Gakkaishi, 54, , Coroneo V., Brandas V., Sanna A., Sanna C., Carraro V., Dessi S., Orrù G., Meloni M. Microbiological characterization of botargo. Classical and molecular microbiological methods. 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