Esercitazione 5: analisi HPLC di una miscela di composti aromatici
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- Romina Ferrante
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1 Esercitazione 5: analisi HPLC di una miscela di composti aromatici Strumentazione e condizioni cromatografiche Cromatografo ad alta pressione Jasko PU-2089 Plus iniettore con loop da 20 L colonna per cromatografia di ripartizione in fase inversa del tipo C18 avente lunghezza 25 cm, diametro interno 4.6 mm, diametro delle particelle dell impaccamento 5 m; rivelatore UV a singola lunghezza d onda Jasko UV-2075 Plus impostato a = 235 nm, con interfaccia analogico-digitale Varian Star 800; computer per l acquisizione e l elaborazione dei dati mediante il software Borwin (Jasko) Tipo di eluizione: isocratica, con una miscela H 2 O/CH 3 OH 40/60 (v/v) contenente acido acetico 0.2 % (v/v), ad un flusso di 1 ml/min. NOTA: La fase mobile è posta a riciclo, essendo trascurabile l interferenza dei fenoli precedentemente iniettati, progressivamente introdotti al suo interno. Soluzioni Soluzione madre dei composti aromatici. All inizio dell esercitazione sarà già disponibile una soluzione, indicata come soluzione 0 e preparata con acqua di grado HPLC, dei seguenti composti: fenolo 4-cloro-fenolo 2,4-diclorofenolo ciascuno ad una concentrazione di 100 ppm ( g/ml) Procedura Accensione e condizionamento del sistema cromatografico All inizio dell esercitazione la fase mobile da utilizzare sarà già pronta e la linea HPLC sarà già predisposta per dare il via alle separazioni cromatografiche. Si procederà dunque all accensione del cromatografo, del rivelatore e del computer (l interfaccia Analogico-Digitale sarà già accesa). 1
2 Verificare che il tasto Degasser, posto sul cromatografo, sia premuto e che la spia Monitor sia accesa e di colore verde. Il display del cromatografo mostrerà i seguenti parametri: Mode: C.F (Constant Flow) Flow (ml/min) : 0 Timer: A Press: 0 (la pressione è misurata direttamente in atm, non in MPa, come indicato) P. Max: 290 P. Min: 0 Per intraprendere le misure HPLC è necessario portarsi al flusso operativo di 1 ml/min. Tale operazione avverrà per stadi, con incrementi di 0.1 ml/min, per non provocare danni all impaccamento della colonna cromatografica. Per passare da 0 a 0.1 ml/min premere il tasto FLOW (tasto 2) sulla tastiera del cromatografo: il valore di Flow sul display lampeggerà. Digitare da tastiera il valore 0.1 e premere il tasto EDIT/ENTER. Il nuovo valore apparirà sul display. Per dare inizio al passaggio di fase mobile in colonna premere il tasto PUMP, posto nella serie di quelli collocati subito sotto il display del cromatografo: la pressione in colonna comincerà a salire. Quando il suo valore sarà diventato stabile sarà possibile ripetere l operazione impostando un flusso di 0.2 ml/min; si procederà allo stesso modo fino al flusso finale di 1 ml/min, al quale corrisponderà una pressione compresa fra 160 e 190 (atm). Verificare che l assorbanza (ABU) indicata dal display del rivelatore UV (che nel frattempo avrà eseguito il self-test iniziale) sia 0, in caso contrario azzerarla premendo il tasto AUTO ZERO, posto nella serie di tasti collocati sotto il display del rivelatore. Preparazione dei campioni e caricamento del loop di iniezione A partire dalla soluzione 0 preparare, SOTTO CAPPA ASPIRANTE, usando ESCLUSIVAMENTE acqua di grado HPLC e facendo uso di una micropipetta da 200 L (P200), le seguenti soluzioni: Soluzione 1, conc. 50 ppm L di soluzione L di acqua HPLC; Soluzione 2, conc. 25 ppm: 200 L di soluzione L di acqua HPLC; Soluzione 3, conc ppm: 200 L di soluzione L di acqua HPLC; Soluzione 4, conc ppm: 200 L di soluzione L di acqua HPLC. Le soluzioni andranno conservate in tubi Eppendorff, disponibili sul bancone di laboratorio. 2
3 Completata la preparazione delle soluzioni e raggiunte le condizioni operative del cromatografo, sarà possibile effettuare la prima iniezione, che riguarderà la soluzione 100 ppm (soluzione 0). A tal fine, prelevare la soluzione con la microsiringa HPLC da 100 L, che verrà fornita dal docente, facendo in modo che non vi siano bolle d aria all interno. Accertarsi che la valvola di iniezione del sistema HPLC sia in posizione LOAD. Posizionare l ago della microsiringa all interno del forellino posto sulla parte anteriore della valvola, spingendolo finché è possibile (si avvertirà un blocco ad un certo punto). Iniettare lentamente la soluzione contenuta nella microsiringa, accertandosi che il suo eccesso goccioli dal tubicino collegato alla porta WASTE (scarico) dell iniettore, posto posteriormente a quest ultimo. NON ESTRARRE LA SIRINGA dopo aver completato l operazione. Il loop di iniezione è ora pronto per la corsa cromatografica. Acquisizione dei cromatogrammi Spostarsi sul computer e lanciare il software Jasco Borwin cliccando sulla relativa icona, posta sul desktop. Apparirà la finestra di Logon, che riporterà come Operator e Group il nome DIDATTICA. Procedere con l OK senza digitare alcuna password. Accertarsi che le icone relative ad una serie di comandi del programma, poste sotto la riga del menù principale, siano visibili. In caso contrario contattare il docente perché potrebbe essere in atto un errata comunicazione fra computer ed interfaccia A/D, che impedirebbe la successiva acquisizione. Portarsi nel menù Run e successivamente nel sotto-menù Start single run Se la comunicazione computer-interfaccia è corretta apparirà l indicazione Start Run on Jasco LC2000. Apparirà la finestra Start Single Run, all interno della quale occorrerà: 3
4 1) indicare il nome del file attribuito al cromatogramma (Run): usare un nome che faccia riferimento al Gruppo di Lavoro e alla concentrazione iniettata 2) specificare se si tratta del primo o del secondo replicato della corsa (Id Num) 3) indicare la durata della corsa (Run length), pari a 10 minuti 4) scrivere eventuali note di commento (ad esempio la concentrazione dei fenoli iniettati o l indicazione che si tratti del campione incognito) 5) controllare che lo Start Mode, riportato in fondo alla finestra, sia impostato su External. Tale impostazione consentirà di dare automaticamente il via al tempo della corsa quando la leva dell iniettore sarà spostata da LOAD ad INJECT. Tutte le altre impostazioni della finestra non sono necessarie nel caso specifico e possono essere lasciate così come appaiono. Completate le operazioni 1-5, premere il tasto RUN: la finestra si chiuderà ed apparirà la finestra in cui verrà via via tracciato il cromatogramma. A questo punto sarà possibile dare inizio alla corsa cromatografica spostando la leva della valvola di iniezione da LOAD ad INJECT con uno scatto netto; solo successivamente si potrà rimuovere la siringa. La registrazione del tracciato avrà inizio automaticamente, non appena la leva dell iniettore verrà portata su INJECT. Subito dopo si potrà sfilare la microsiringa dalla valvola e sciacquarla con acqua HPLC. Dopo che il tracciato sarà stato completamente disegnato sul monitor e salvato sull hard disk del computer si potrà riportare la leva dell iniettore nella posizione LOAD. Elaborazione dei dati Il software Borwin consente di lavorare in modalità multi-tasking, dunque sarà possibile aprire il file relativo ad un cromatogramma acquisito in precedenza ed effettuare le relative elaborazioni mentre è in corso l acquisizione del cromatogramma successivo. Per procedere con l elaborazione occorre portarsi nella finestra principale del programma ed accedere al menù File > Open File, successivamente occorre selezionare il file da aprire nella File List e dare l OK: il cromatogramma verrà mostrato nella finestra. 4
5 Cliccare sull icona Edit posta in alto: apparirà la finestrella Edit Peak, contenente a sua volta 8 icone. Cliccare sull icona New: il puntatore assumerà la forma di una mano, con l indice che punta a destra, e sarà vincolato al tracciato cromatografico. Spostare il puntatore in un punto del tracciato posto a sinistra del primo picco eluito (fenolo) e cliccare sul tasto sinistro del mouse: il puntatore cambierà forma, diventando una mano che punta a sinistra. Spostarlo in un punto a destra del picco e cliccare sul tasto sinistro del mouse. Se l operazione è andata a buon fine apparirà la finestra Change Peak Name, che consentirà di scrivere il nome del composto eluito (in questo caso il fenolo) e confermare l assegnazione premendo il tasto Done. I punti del tracciato su cui si è cliccato in precedenza rappresenteranno i limiti sinistro e destro di integrazione e verranno visualizzati come segmenti rivolti verso l alto e il basso, rispettivamente. Contestualmente il software riporterà, in corrispondenza del massimo del picco, il nome assegnato al composto. Attenzione: se ci si accorge si aver scelto in modo errato i limiti del picco (ad esempio se essi sono troppo vicini ai punti in cui il segnale cromatografico comincia ad aumentare o sta per annullarsi) è possibile modificarne la posizione cliccando sull icona Edit (destra) nella finestrella Edit Peak. Il cursore assumerà la forma di un segmento obliquo. Portandolo in un punto del tracciato compreso fra i limiti fissati in precedenza e tenendo premuto il tasto sinistro del mouse si potrà modificare la posizione di uno o entrambi i limiti, che verrà fissata quando verrà rilasciato il tasto sinistro del mouse. Per uscire dall opzione Edit (destra), così come dalle altre opzioni della finestra Edit peak, è sufficiente cliccare una volta sul tasto destro del mouse. Si potrà dunque tornare all opzione New e ripetere le operazioni finora descritte per i restanti due picchi, relativi a 4-cloro-fenolo e 2,4-dicloro-fenolo, in ordine di eluizione. Premendo sul tasto sinistro del mouse quando il puntatore si trova all interno del picco si farà apparire la finestra Peak Information, che consentirà di visualizzare tutti i parametri di ciascun picco. A questo punto il cromatogramma elaborato andrà salvato mediante il comando File > Save > Save current. Successivamente andranno salvati il tracciato e le informazioni di integrazione. A tal fine il tracciato va copiato nella Clipboard mediante il comando Edit > Copy to clipboard e successivamente incollato in un file di Word
6 Successivamente i dati di integrazione possono essere visualizzati mediante il comando Peaks > Peak Report La finestra relativa va copiata nella clipboard cliccando sulla terza icona da sinistra e successivamente incollata nello stesso file Word contenente il tracciato cromatografico. Il file Word andrà salvato, con un nome che faccia riferimento chiaramente al gruppo di lavoro, nella cartella dedicata alle esercitazioni, presente sul desktop del computer. Completamento della sequenza di iniezione degli standard e valutazione dell altezza di piatto teorico. Seguendo le istruzioni riportate negli ultimi due paragrafi procedere con la sequenza di iniezione degli standard, che sarà costituita da due replicati per ogni soluzione, nell ordine da 0 a 4. Al termine delle operazioni il file di Word salvato nella cartella LabChimAnII dovrebbe contenere tutti i tracciati cromatografici ottenuti e le relative informazioni. Sulle ultime due corse cromatografiche, relative alla soluzione 4 (6.25 ppm per ciascun analita), andrà eseguita la valutazione delle altezze di piatto teorico a partire dal tempo di ritenzione e dalla larghezza alla base di ciascuno dei tre picchi cromatografici presenti nel cromatogramma. A tal fine occorrerà effettuare, in successione, lo zoom su ciascuno dei picchi del tracciato, cliccando sulla seconda icona da sinistra (nel menù principale di Borwin) e disegnando la finestra di zoom con il tasto sinistro del mouse premuto. Lo zoom dovrà contenere integralmente il picco. In caso di errore si dovrà tornare indietro, cliccando sulla prima icona da sinistra del menù, e ripetere l operazione. Lo zoom andrà copiato nella clipboard (sempre con il comando Edit > Copy to clipboard) ed incollato nel file di Word già contenente le informazioni di tipo quantitativo. Nello stesso file andranno incollati anche gli zoom degli altri due picchi e si procederà poi al trasferimento del file su pen drive personale. Le larghezze alla base di ciascun picco verranno ricavate con il metodo delle tangenti nei punti di flesso, da disegnare manualmente sulla stampa dei tracciati espansi. 6
7 Dopo aver eseguito il ciclo completo di misure sulle cinque soluzioni sarà possibile costruire le rette di taratura per fenolo, 4-cloro-fenolo e 2,4-diclorofenolo, riportando le aree dei rispettivi picchi cromatografici in funzione della concentrazione iniettata. Per la costruzione delle rette si avranno a disposizione in tutto 10 punti (i due valori ottenuti per ciascuna concentrazione NON vanno mediati). Le rette verranno poi sottoposte al trattamento con il metodo dei minimi quadrati ed andrà calcolato il limite di rivelabilità per i tre analiti. Anche in questo caso occorre calcolare il LOD con entrambi i metodi spiegati a lezione e seguire la convenzione sulle cifre significative nel riportarne il valore. Analisi del campione incognito A ciascun gruppo di lavoro verrà fornito, nella fase finale dell esercitazione, un campione contenente fenolo, 4-cloro-fenolo e 1,4-diclorofenolo a concentrazione incognita. Su tale campione verranno effettuate DUE corse cromatografiche e successivamente si procederà alla loro elaborazione, salvando i tracciati e i dati quantitativi sul file di Word predisposto in precedenza. Partendo dal valore medio delle aree di picco ottenute in queste due corse andrà valutata la concentrazione, con relativo intervallo di fiducia, di ciascuno dei tre analiti, sfruttando le relative rette di calibrazione. NOTA IMPORTANTE: al termine delle corse cromatografiche le soluzioni fenoliche andranno scaricate, sotto cappa aspirante, nel contenitore apposito. Successivamente i tubi Eppendorff che le contenevano andranno sciacquati con acqua HPLC, trasferendo al loro interno circa 1 ml di questa con la pipetta P1000, tappandoli e agitandoli vigorosamente. Anche l acqua di lavaggio andrà poi scaricata nel contenitore di cui sopra. 7
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