Organizzazione strutturale del muscolo scheletrico

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Elisa Fiore
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Organizzazione strutturale del muscolo scheletrico Il tessuto muscolare è un tipo particolare di tessuto responsabile dei movimenti volontari ed involontari del corpo.

1 Organizzazione strutturale del muscolo scheletrico Il tessuto muscolare è un tipo particolare di tessuto responsabile dei movimenti volontari ed involontari del corpo. Il tessuto muscolare consta di tre elementi: - le fibre muscolari che si dispongono in fasci - una rete capillare abbondante - un importante tessuto connettivo composto da fibre elastiche e collagene che fa da sostegno al muscolo stesso.

2 Il tessuto muscolare scheletrico (o striato)... È volontario È formato da elementi cellulari lunghi e sottili, detti fibre muscolari striate o fibrocellule, lunghe da 1 a 100 cm, a forma vagamente cilindrica, con numerosi nuclei (anche centinaia) posti a ridosso del sarcolemma (si denomina così la membrana cellulare delle cellule muscolari) e, soprattutto, con una caratteristica striatura trasversale È costituito da fibre muscolari di due tipi differenti dal punto di vista funzionale: fibre di tipo I, dette anche lente o rosse, sono caratterizzate da bassa attività ATPasica, si contraggono lentamente e poco intensamente e tollerano maggiormente la fatica. Presentano grandi quantità di enzimi mitocondriali e producono ATP prevalentemente tramite la glicolisi aerobica e la fosforilazione ossidativa ad essa associata; fibre di tipo II, dette anche veloci o bianche, sono caratterizzate da elevata attività ATPasica, si contraggono rapidamente ed intensamente ma tollerano poco la fatica. Presentano grandi quantità di enzimi glicolitici e producono prevalentemente ATP tramite la glicolisi anaerobica. Le fibre veloci si suddividono ulteriormente in tre classi: tipo A, B (a più intensa attività glicolitica) ed X.

La miofibrilla è il modulo costitutivo del muscolo scheletrico Nelle fibrocellule le miofibrille sono composte dall'associazione di due tipi di filamenti, detti f. spessi e f. sottili.

3 La miofibrilla è il modulo costitutivo del muscolo scheletrico Nelle fibrocellule le miofibrille sono composte dall'associazione di due tipi di filamenti, detti f. spessi e f. sottili. I filamenti spessi sono composti prevalentemente dalla miosina, che presenta una testa globosa ed una coda filamentosa. Molte proteine di miosina si associano a formare un filamento spesso disponendosi con le code che guardano verso il centro e le teste poste all'estremità e sporgenti verso l'esterno a formare dei ponti trasversali; questi si ripetono periodicamente e flettendosi prendono parte attiva nella contrazione muscolare provocando lo scorrimento reciproco dei filamenti (sottili e spessi). I filamenti sottili sono prevalentemente composti da actina, una proteina a struttura globulare che polimerizza formando strutture filamentose le quali, associate ad altre proteine, costituiscono i filamenti sottili.

Forme multiple di MHC esistono nei vari tipi muscolari (scheletrico, cardiaco, liscio) a seconda della funzione fisiologica di un determinato muscolo.

4 Le miosine Le miosine sono proteine di 480 kda note per l interazione con l actina nelle cellule muscolari e non. Sono formate da due catene pesanti identiche (MHC), di circa 200 kda ciascuna, e da quattro catene leggere (MLC), con pesi molecolari che vanno dai 15 ai 26 kda. Forme multiple di MHC esistono nei vari tipi muscolari (scheletrico, cardiaco, liscio) a seconda della funzione fisiologica di un determinato muscolo. Sono due le classi di MHC: - Tipo I, associato alle fibre lente (slow-twitch fibers). - Tipo II, associato alle fibre veloci (fast-twitch fibers). Al gruppo delle miosine di tipo II fanno parte le fibre IIa, IIb e IIx. Obiettivo dell esercitazione di laboratorio n.1: distinguere le diverse tipologie di miosine in muscolo scheletrico di ratto mediante immunofluorescenza e colorazione metabolica

La matrice extracellulare (MEC) è fondamentale nel conferire le caratteristiche peculiari del muscolo scheletrico La MEC è composta da fibre proteiche insolubili (collageno, f. elastiche e f.

5 La matrice extracellulare (MEC) è fondamentale nel conferire le caratteristiche peculiari del muscolo scheletrico La MEC è composta da fibre proteiche insolubili (collageno, f. elastiche e f. reticolari) e sostanza fondamentale, formata da mucopolisaccaridi acidi, glicoproteine, proteoglicani, glucosamminoglicani o GAG (acido ialuronico, coindroitinsolfato, cheratinsolfato, eparinsolfato ecc.) e in minor misura da proteine, fra cui la fibronectina. La MEC è secreta dalle numerose cellule del tessuto connettivo e ha diversi importanti ruoli: strutturale, difensivo, trofico e morfogenetico, organizzando e influenzando la crescita e la differenziazione dei tessuti circostanti. Il tessuto connettivo struttura i muscoli, anatomicamente e funzionalmente, in catene miofasciali (sistema miofasciale), assumendo pertanto un ruolo fondamentale nell equilibrio e nella postura; Ogni muscolo è tenuto in sede tramite lamine connettivali (aponeurosi o aponevrosi) ed è racchiuso nelle fasce (perimisio ed endomisio).

6 Il tessuto connettivo muscolare è ricco in fibre collageno Il collageno... Costituente del tessuto connettivo, insieme a elastina, fibrillina e proteoglicani, tutti prodotti da fibroblasti, condroblasti, osteoblasti È la proteina più abbondante nei mammiferi (25% del loro peso): presente in cartilagine, tendini, legamenti, osso, matrice extracellulare, membrane basali, cornea e cristallino. Esistono 28 tipi diversi di collageno, codificata da almeno 18 geni Insolita composizione aa: 30% Gly, 20% Pro e OH-Pro (basso valore nutrizionale)

7 Tipi di Collageno Esistono numerosissimi tipi di collageno propriamente detto e diverse proteine che hanno struttura polipeptidica largamente assimilabile al collageno. In letteratura sono stati finora descritti 28 tipi diversi. Tipo I II III V XII Descrizione Rappresenta il 90% del collageno totale ed entra nella composizione dei principali tessuti connettivi, come pelle, tendini, ossa Forma i dischi intervertebrali, la cartilagine e il corpo vitreo Grande importanza nel sistema cardiovascolare. Viene prodotto velocemente ed in grandi quantità prima del collageno di tipo I, più resistente, da cui è successivamente sostituito Contenuto nel tessuto interstiziale, è associato al collageno di tipo I. È molto abbondante nel tessuto muscolare É un collageno transmembrana, che interagisce con l integrina a1b1, con la fibronectina e con i componenti della membrana basale

Isolamento delle fibre di muscolo scheletrico di TA mediante trattamento con collagenasi tipo I Dissociare il muscolo in incubazione a 37 C (5% CO 2 ) in una soluzione di D-MEM contenente: 0.

8 Isolamento delle fibre di muscolo scheletrico di TA mediante trattamento con collagenasi tipo I Dissociare il muscolo in incubazione a 37 C (5% CO 2 ) in una soluzione di D-MEM contenente: 0.2% Collagenasi tipo I 2% Fetal Bovine Serum (FBS) 1mg/ml pen/strep, per 60 minuti; Bloccare l azione della Collagenasi I rimuovendo il mezzo e sostituendolo con DMEM + antibiotici Separare le fibre allo stereomicroscopio utilizzando una pipetta Pasteur o, se necessario, delle pinze chirurgiche.

9 Isolamento del tibiale anteriore da ratto adulto (3 m.o.) TA

10 Isolamento del tibiale anteriore da ratto adulto

11 Isolamento delle fibre di muscolo scheletrico di TA Le fibre isolate sono prelevate con una pipetta Pasteur e depositate su vetrini portaoggetto, precedentemente trattati con Poli-D-Lisina 1 mg/ml, per favorirne l adesione.

Tipizzazione delle miosine su fibre isolate da tibiale anteriore mediante immunofluorescenza Effettuare un paio di lavaggi rapidi in PBS e fissare in formalina 4% per 10 minuti Rimuovere la formalina

12 Tipizzazione delle miosine su fibre isolate da tibiale anteriore mediante immunofluorescenza Effettuare un paio di lavaggi rapidi in PBS e fissare in formalina 4% per 10 minuti Rimuovere la formalina ed effettuare tre lavaggi da 5 con PBS Permeabilizzare con Triton X-100 0,3% per 10 Saturare con PBS-gelatina 0,1% per 10 Incubare le fibre con l anticorpo primario opportunamente diluito per 60 a temperatura ambiente. Rimuovere l anticorpo primario ed effettuare un paio di lavaggi rapidi con PBS-gelatina 0,1%, quindi incubare con il relativo anticorpo secondario opportunamente diluito (Alexa Fluor, Molecular Probe) per 60 a temperatura ambiente. Rimuovere l anticorpo secondario e lavare le fibre con PBS high salt per 1 Effettuare tre lavaggi rapidi in PBS e montare i vetrini con mezzo di montaggio + DAPI. Osservare al microscopio.

13 Fibra di TA isolata (ingrandimento 16X) Blu = nuclei Verde = actina Rosso = AQP4 Fibra di TA isolata (ingrandimento 100X) È possibile osservare il marcaggio dell actina e il tipico bandeggio trasversale

14 Tipizzazione delle miosine su sezioni trasversali seriate di TA di ratto mediante immunofluorescenza Saturare con PBS-gelatina 0,1% per 10 Incubare le fibre con l anticorpo primario opportunamente diluito per 60 a temperatura ambiente. Rimuovere l anticorpo primario ed effettuare un paio di lavaggi rapidi con PBS-gelatina 0,1%, quindi incubare con il relativo anticorpo secondario opportunamente diluito (Alexa Fluor, Molecular Probe) per 60 a temperatura ambiente. Rimuovere l anticorpo secondario e lavare le fibre con PBS high salt per 1 Effettuare tre lavaggi rapidi in PBS e montare i vetrini con mounting medium + DAPI. Osservare al microscopio.

Colorazione metabolica della succinato deidrogenasi (SDH) su sezione trasversale di TA di ratto Incubare la sezione di muscolo per 60 con la soluzione d incubazione SDH a 37 Soluzione SDH:

15 Colorazione metabolica della succinato deidrogenasi (SDH) su sezione trasversale di TA di ratto Incubare la sezione di muscolo per 60 con la soluzione d incubazione SDH a 37 Soluzione SDH: - NitroBlue Tetrazolium (NBT) 0,1% - Sodio succinato 0,2 M - Buffer fosfato 0,2 M ph 7,4 Effettuare tre lavaggi rapidi con acqua e montare con mezzo di montaggio. Osservare al microscopio.

16 Schema sperimentale per immunofluorescenza e colorazione SDH Anticorpo mouse anti-mhc I (BA-D5) Anticorpo mouse anti-mhc IIa (SC-71) Anticorpo mouse anti-mhc (slow+fast) eccetto IIx (BF-35) Substrato per l enzima succinato deidrogenasi (SDH) TA ratto

17 BA-D5 Slow-twitch fibers SC 7.1 IIa fast-twitch fibers BF-35 All the fibers but IIx

18 Intensità della colorazione proporzionale all attività ossidativa! Tipo I (SO) Tipo IIa Tipo IIx Tipo IIb (FG) Metabolismo ossidativo Viola intenso Metabolismo glicolitico Bianco

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