Effetti endocrini delle micotossine Annamaria Colacci, Monica Vaccari, Maria Grazia Mascolo, Stefania Perdichizzi, Elena Morandi, Francesca Rotondo,

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1 Effetti endocrini delle micotossine Annamaria Colacci, Monica Vaccari, Maria Grazia Mascolo, Stefania Perdichizzi, Elena Morandi, Francesca Rotondo, Paola Silingardi Eccellenza Cancerogenesi Ambientale Agenzia Regionale Prevenzione e Ambiente Emilia Romagna

2 Inquadramento del problema Incremento dei ritrovamenti Variazioni climatiche Non conformita dei prodotti di importazione da Paesi non UE Diminuzione dei limiti ammessi REG CE N. 1126/2007 del 28/09/07 (modifica il REG CE N. 1881/2006) Necessita di strumenti piu sensibili per l identificazione Maggiori informazioni per una stima piu puntuale dei rischi

3 Effetti tossici delle micotossine Micotossina Effetto Aflatossina B1 Epatotossico, iperplasia del dotto biliare, emoraggia renale e intestinale, tumore del fegato (IARC Gruppo 1 Aflatossina M1 peobabile cancerogeno (IARC Gruppo 2B) Ocratossina A Fumonisina B1 Patulina Tricoteceni Zearalenone Ergotina Nefrotossico, teratogeno, immunosoppressore, cancerogeno renale Epatotossico, nefrotossico, probabile tumore del fegato e dell esofago (?) (IARC Gruppo 2B) Emorragia polmonare, convulsione, edema cerebrale, mutagena, embriotossica, immunotossica Vomito, diarrea, sanguinamento, dispnea, prurito, allergia, possibile cancerogeno (IARC Gruppo 3) Estrogenosimile Neurotossico

4 Sviluppo di strumenti diagnostici innovativi per la rapida identificazione di classi di contaminanti in matrici alimentari

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6 Fumonisine La fumonisina B1 1,2,3- propanetricarboxylic acid una struttura molecolare molto simile a quella dello scheletro degli sfingolipidi, il che fa sì che questa micotossina agisca come inibitore dell enzima ceramide sintasi, meccanismo che sembra essere cruciale per la tossicità e cancerogenicità indotta da fumonisina B1.

7 Prodotti alimentari Fumonisine B 1 +B 2 REG CE N. 1126/2007 del 28/09/07 (modifica il REG CE N. 1881/2006) Granoturco non trasformato ad eccezione di quello destinato alla molitura ad umido Granoturco destinato al consumo umano diretto, prodotti a base di granoturco destinati al consumo umano diretto, eccetto i quelli indicati successivamente Tenori massimi in µg/kg 4000* 1000* Cereali da colazione e merende a base di granoturco 800* Alimenti a base di granoturco ed altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni > 500 micron.. Frazioni della molitura del granoturco di dimensioni < 500 micron.. 200* 1400* 2000* cortesia Cecilia Bergamini ARPA-ER *si applica dal 01/10/07

8 Livelli di contaminazione da fumonisine nei diversi Paesi UE Final Report SCOOP 2003

9 Analisi FUMONISINE B1 e B2 nel mais 35 campioni di farina di mais, 1 granella di mais (5 campioni presentano contaminazione superiore al limite 2000 µg/kg, la granella è conforme perché < 5000 µg/kg) > 2000 µg/kg < LDR da 1000 a 2000 µg/kg 16% 5% 16% 63% < 1000 µg/kg cortesia Cecilia Bergamini ARPA-ER Le fumonisine sono state determinate anche in 1 campione di olio di mais, 1 campione di miglio biologico e in 2 campioni di farina di grano tenero (risultati positivi circa 70 µg/kg tot)

10 Zearalenoe Zearalenone (ZEA), noto anche come RAL e micotossina F-2 è un potente metabolita ad azione estrogenica prodotto da alcune specie di Fusarium. ed in particolare F. graminearum, F. culmorum e F. equiseti, Lo zearalenone, chimicamente è il lattone dell acido resorciclico, e i suoi principali metaboliti sono l alfa ed il beta Zearalenolo

11 Prodotti alimentari Zearalenone REG CE N. 1126/2007 del 28/09/07 (modifica il REG CE N. 1881/2006) Cereali non trasformati diversi dal granoturco 100 Granoturco non trasformato ad eccezione di quello destinato a molitura ad umido Cerali destinati al consumo umano diretto, farina di cereali,crusca e germe destinati al consumo umano diretto, eccetto i quelli indicati successivamente 350* Olio di granoturco raffinato 400* Pane, prodotti da forno e cereali da colazione esclusi quelli a base granoturco Granoturco destinato al consumo umano diretto, merende a base di 100* granoturco e cereali da colazione a base di granoturco Alimenti a base di cereali trasformati destinati ai lattanti e ai bambini 20 Alimenti a base di granoturco destinati ai lattanti e ai bambini 20* Tenori massimi in µg/kg *si applica dal 01/07/07

12 cortesia Cecilia Bergamini ARPA-ER Zearalenone N reg Campione di Zearalenone µg/kg DON µg/kg Afla B1 e tot µg/kg Creackers integrali < 4 168,5 < Bastoncini crusca < 4 < 80 < Fette biscottate < 4 < 80 < Cereali 1a colazione < 4 < Cornflakes 44,9 385,6 < Fiocchi frumento integrale < 4 < 80 < Farina di mais < 4 < Farina integrale < 4 < Fiocchi di riso e frumento < 4 < Mix cereali < 4 < Fiocchi di riso < 4 < Farina di farro biologica < 4 < Farina di farro biologica < 4 < 0.5

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14 EFFETTI CITOTOSSICI E TRASFORMANTI IN CELLULE BALB/c 3T3 ENDPOINT Dose saggiata Dose minima Citotossicità Trasformazione Composto Dose saggiata Dose minima efficace (a) efficace (a) A µm 0.5 µm µm PCB-Mix µm 0.1µM µm Fumonisina µm 30 µm ND ND Zearalenone 10 nm 40 µm NS NS NS Penconazolo µm 100 µm NS NS (a) Dose minima che indotto effetti significativi. NS = nessun effetto significativo; ND = non determinato FUMONISINA B1 Non trasformante fino a 1.36 mm PROCIMIDONE Trasformante in BALB/c 3T3 AFLATOSSINA M1 Potenza cancerogena inferiore di un ordine di grandezza rispetto a AFB1

15 SAGGIO DI VITALITA - LINEE CELLULARI Linea cellulare Caratteristiche Tempo di raddoppiamento (hr) Assetto recettoriale MCF-7 Adenocarcinoma mammario, Differenziate, Non metastatiche 61 Risposta funzionale agli estrogeni positiva; mrna per ER α mrna per ER β HepG2 Carcinoma epatocellulare 35 Recettori per l insulina e per l IGF II T47D Adenocarcinoma mammario, metastatiche 32 Recettori per gli androgeni, gli estrogeni,progesterone e recettore Ah

16 SAGGIO DI VITALITA - CALCOLO DELLA GI50 Modello Cellulare MCF7 T47D HepG2 Composto 24h 48h 72h 6g 24h 48h 72h 6g 24h 48h 72h 6g A1260 ( µm) PCB-Mix ( µm) Fumonisina ( µm) Zearalenone ( µm) Aflatossina M1 ( µm) Procimidone ( µm) Penconazolo ( µm) NS = nessun effetto significativo NS NS NS NS NS NS

17 ATTIVITÀ ESTROGENICA IN CELLULE T47D Composto Risultato in E- Screen Dose minima efficace A1260 Negativo NS PCB-Mix Negativo NS Fumonisina Negativo NS Zearalenone Positivo 1.8 nm Penconazolo Negativo NS Procimidone Negativo NS ZEARALENONE RPE = 0.025

18 VALUTAZIONE DELLA MODULAZIONE TRASCRIZIONALE MARCATORI DI PATHWAY gene PDZK (pathway degli estrogeni) DOSE Zearalenone 2 nm CONTROLLO POSITIVO 17 beta estradiolo 10 nm DURATA DEL TRATTAMENTO 4 h 16 h

19 T47D: gene PDZK 6 ** 4 ore 2^- Ct ore * 0 DMSO E2 MetOH Zea

20 Studio in microarray 1. Trattamento della linea MCF-7 con 20 µm ZEA per 72 h 2. Estrazione e purificazione dell RNA totale 3. Linear amplification e sintesi di crna fluorescente 4. Lavaggi e scansione delle slide 5. Analisi mediante il software Feature Extraction 6. Elaborazione dati 7. Interpretazione biologica

21 DISEGNO SPERIMENTALE Marcatura dell RNA Fluorofori utilizzati: Cy3 (570 nm) e Cy5 (670 nm) verde rosso Slide diretta: controllo marcato con Cy3 trattato marcato con Cy5 Replica in dye-swap: scambio dei fluorofori (controllo-cy5, trattato-cy3)

22 ANALISI dell RNA ESTRATTO Campioni: trattato con ZEA e non trattato (controllo) QUANTIFICAZIONE Lettura allo spettrofotometro (260 e 280 nm) Calcolo della concentrazione (µg/ml) CONTROLLO QUALITA Analisi al Bionanalyzer Agilent 2100 Profili qualitativi Controllo Trattato

23 Dalla LINEAR AMLIFICATION alla scansione 1) Retrotrascrizione Materiale di partenza 2) Trascrizione e marcatura con Cy3 e Cy5 3) Purificazione 4) Quantificazione dell incorporazione di fluorescenza Prodotti Mix dei prodotti Ibridazione su slide Scansione slide

24 Piattaforma Agilent Un laser SHG-YAG (532nm) e un laser a Elioneon (633nm), per eccitare i fluorocromi Cy3 e Cy5. Carosello a 48 posizioni Sistema distintivo di continua messa a fuoco automatica dei laser sul piano esatto del campione durante la scansione Software di Feature Extraction

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28 SELEZIONE DEI GENI Match delle due repliche Filtro: P-VALUE < 0,05 Lista di 530 GENI Tool di interpretazione biologica: GOMINER

29 GO term mytotic cell cycle.

30 GO term apoptosis

31 GO term EGFR activity, AhR binding ed ER binding.

32 Modulazione di pathway coinvolti nella risposta estrogenica nella risposta estrogenica modulazione della cascata di segnale mediata da recettori estrogeni (ER) effetto di ZEA sul pathway di aryl hydrocarbon receptor (AhR) Effetto sul pathway di epidermal grow factor recetor (EGFR)

33 Modulazione di pathway coinvolti nella risposta estrogenica nella risposta estrogenica Significativamente modulata la categoria del legame ai recettori per gli estrogeni NRIP1 (nuclear receptor interacting protein 1) cofattore attivato dal recettore per gli estrogeni con un ruolo importante nella modulazione negativa dell espressione del recettore RERG (ras-like estrogen regulated growth inhibitor). inibitore della proliferazione cellulare in linee di carcinoma mammario ER-positive altri marcatori del pathway di risposta agli estrogeni PDZK1, HSP27, GREB1 e catepsina D che sono risultati tutti up-regolati.

34 MTT TEST: RISULTATI Lettura al Multiwell Reader con filtri 540/690 nm Assorbanza MTT Vitalità Giorni NT MetOH 2 nm 10 nm 25 nm 50 nm 0.1 µm 1 µm 10 µm 20 µm Inibizione significativa della proliferazione cellulare alla dose 20 µm

35 ZEARALENONE 2 nm (IE) 10 nm 50 nm ( LMR) 100 nm NT N dosi = 4

36 e le fumonisine?

37 FUMONISINA B1 1 µm 3 µm ( LMR) ( GI50) 10 µm 30 µm NT N dosi = 4

38 Analisi al microtox della tossicità della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B Fumonisina B1 Fumo B1+Fumo B2 (22 ppm) % effect FB ppm FB1 45 ppm FB1 90 ppm

39 Ringraziamenti Caratterizzazione micotossine Cecilia Bergamini Tossicologia sperimentale Monica Vaccari Stefania Perdichizzi Francesca Rotondo Tossicogenomica Paola Silingardi Elena Morandi Maria Grazia Mascolo

40 1. Analisi al microtox della tossicità acuta della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1. 2. Analisi al microtox della tossicità acuta di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale 3. Disegno di una slide-microarray per il Vibrio Fischeri. 4. Messa a punto del protocollo di estrazione e marcatura dell RNA procariotico

41 Analisi al microtox della tossicità della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1 Fumonisina B2 Fumonisina B1

42 Analisi al microtox della tossicità della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1

43 Analisi al microtox della tossicità della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1 EC50 Fumo B2: 93 mg/l EC50 Fumo B1: 47 mg/l

44 Analisi al microtox della tossicità della fumonisina B2 pura e in combinazione con la fumonisina B1

45 Analisi al microtox della tossicità acute di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale Tipologia di FB1 (µg/kg) FB2 (µg/kg) campione Farina di mais Farina di mais Farina di mais Farina di mais Farina di mais Farina di mais <32 19

46 Analisi al microtox della tossicità acute di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale Conc. FB1 di partenza (ppb) conc testata in microtox (µg/l)

47 Analisi al microtox della tossicità acute di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale campione Conc. testata al microtox (90%) in mg/l bianco 90 bianco 13 bianco 27 bianco 53 bianco 107 bianco 213 bianco 438 bianco 757 bianco 1529 bianco 2664

48 Analisi al microtox della tossicità acute di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale

49 Analisi al microtox della tossicità acute di farine di mais contaminate da fumonisine (B1 e B2): analisi della matrice tal quale

50 Disegno di una slide-microarray per il Vibrio Fischeri ES114 Total Number of all DNA molecules: % Total Size of all DNA molecules: bp % Number of Primary Annotation coding bases: bp 86.40% Number of TIGR Annotation coding bases: bp 86.28% Number of G+C bases: bp 38.35% Primary Annotation Summary Total genes: % Protein coding genes: % Genes assigned a role category: % Genes not assigned a role category: % Conserved hypothetical genes: % Hypothetical genes: % TIGR Automated Annotation Summary Total genes: % Protein coding genes: % Genes assigned a role category: % Genes not assigned a role category: % Conserved hypothetical genes: % Hypothetical genes: % trna genes: % rrna genes: %

51 Disegno di una slide-microarray per il Vibrio Fischeri ES114

52 Messa a punto del protocollo di estrazione e marcatura dell RNA procariotico Partendo da 100 ng di RNA tot arriviamo ad ottenere 7.8 µg gamma di crna marcato con circa 17pmoli di Cy5 CTP incorporato ogni µg di crna

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55 PENCONAZOLO 50 nm 0.5 µm ( LMR) 5 µm 15 µm ( GI50) NT N dosi = 4

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57 SCELTA DEL DESIGN SPERIMENTALE GLI STEP DI LAVORO I step individuazione del pattern di geni che permette di stabilire la presenza o meno di una molecola II step test del pattern di geni con campioni di cui è nota la contaminazione III step applicazione su matrice ambientale di cui non è nota la contaminazione

58 Tipo campione Numero di campioni analizzati Percentuale di campioni positivi Grano % Farine di grano % Prodotti a base di grano % Mais % Farine di mais % Prodotti a base di mais % Riso % Prodotti a base di riso % Orzo % Avena % Segale % Baby food % Latte %

59 Linea cellulare MCF-7 Caratteristiche Adenocarcinoma mammario, Differenziate, Non metastatiche Tempo di raddoppiamento (hr) 61 Assetto recettoriale Risposta funzionale agli estrogeni positiva; mrna per ER α mrna per ER β HepG2 Carcinoma epatocellulare 35 Recettori per l insulina e per l IGF II T47D Adenocarcinoma mammario, metastatiche 32 Recettori per gli androgeni, gli estrogeni,progesteron e e recettore Ah

60 I STEP: POSSIBILI ANALISI Come possiamo individuare il pattern di geni per una certa molecola? Possibili analisi per molecola Uno : ANALISI 1 : M1 vs NT ANALISI 2 : M1 vs {M2,M3,M4,M5}

61 LE NOSTRE RISORSE 90 microarray slide (human, 44k) 2 protocolli sperimentali One Colour Two Colour 5 molecole pure da estratto

62 DESIGN SPERIMENTALE CON TWO COLOUR M1 dose 1 M1 dose 4 M2 dose 1 M2 dose 4 M5. dose 1 M5 dose 4 NT N dosi = 4