2,5 ESANDIONE URINARIO FREE in FLUORIMETRIA Codice Z05510

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1 2,5 ESANDIONE URINARIO FREE in FLUORIMETRIA Codice Z05510 BIOCHIMICA Il 2,5 Esandione o Acetonylacetone è un dichetone alifatico prodotto dalla trasformazione biochimica dell idrocarburo alifatico Esano. Questo idrocarburo alifatico, presente come solvente nelle colle usate soprattutto dall industria calzaturiera, una volta assunto dall organismo viene immediatamente metabolizzato fino a trasformarsi in 2,5 Esandione, il quale, sotto forma di glucuronide, viene escreto con le urine. Una quota viene escreta nelle urine come 2,5 Esandione libero. Il 2,5 Esandione viene ricercato nelle urine e determinato quantitativamente per accertare il grado di esposizione individuale poichè la concentrazione urinaria è proporzionale alla quantità di Esano inspirato nell aria durante il ciclo lavorativo. Il 2,5 Esandione viene ritenuto il diretto responsabile delle polineuropatie che si riscontrano tra gli addetti dell industria calzaturiera. ANALISI CHIMICA HPLC Il 2,5 Esandione (PM=114,14) è un dichetone alifatico abbastanza volatile, non analizzabile direttamente poiché scarsamente sensibile all Ultravioletto. Il presente metodo consente di determinare le concentrazioni urinarie del 2,5 Esandione Libero in HPLC. Il 2,5 Esandione viene derivatizzato con un reagente specifico e dopo una purificazione SPE viene iniettato in HPLC isocratico con detector Fluorimetrico. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 014 Esandione urinario frazione libera in Fluorimetria Giugno

2 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: Il presente metodo consente di determinare quantitativamente le concentrazioni urinarie di 2,5 Esandione frazione libera in HPLC. Il 2,5 Esandione viene derivatizzato con un reagente specifico, viene purificato mediante colonne di clean-up C18 e iniettato direttamente in HPLC isocratico con detector Fluorimetrico. Recupero del Metodo : circa 97,5% Sensibilità del Metodo : 0,01 µg/ml Range dinamico del metodo : 0,01 40,0 µg/ml Range di normalità : Contenuto della confezione : 0,05 0,5 µg/ml Rif. ACGIH Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a temperatura ambiente ( 20 C ) Reagente A Soluzione Derivatizzante, 1 x 80 ml Reagente B Soluzione Tampone, 2 x 80 ml Reagente C Soluzione di Condizionamento 1, 2 x 100 ml Reagente D Soluzione di Condizionamento 2, 1 x 200 ml Reagente E Soluzione di Lavaggio, 3 x 200 ml Reagente F Soluzione di Eluizione, 1 x 60 ml Reagente G Soluzione Test a 39 mg/l, 1 x 5 ml Reagente H Soluzione Test / Standard chimico, 1 x 5 ml Vedi Avvertenze Reagente M Fase Mobile, 6 x 500 ml Colonne di Clean-up 100 pz Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da 100 µl Detector fluorimetrico λ EX =273 nm λ EM =450 nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale Autocampionatore. Computer gestionale Modalità per il prelievo urinario : Alla fine del turno lavorativo, raccogliere 10 ml di urine in una provetta idonea. Stabile 4 settimane a 20 C. E preferibile che il ph sia leggermente acido ( 2,0 < ph < 4,0) 2

3 PROCEDURA PREANALITICA Preparazione della Soluzione Test Trasferire in una provetta di vetro da 10 ml con tappo a vite: Test Reagente H Soluzione Test 600 µl Reagente A Sol. Derivatizzante 600 µl Reagente B Sol. Tampone 1200 µl Al vortex per 10 secondi Incubare a 70 C per 1 h Raffreddare INIEZIONE : Iniettare 100 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia un tempo di ritenzione simile a quello riportato in fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questa Soluzione così ottenuta non deve essere usata come calibratore PROCEDURA ANALITICA Preparazione degli Standards di Calibrazione FASE 1: In una provetta da 10 ml pipettare : 900 µl di H 2 O di grado HPLC 100 µl di Reagente H - Standard Chimico Si otterrà una Soluzione Standard contenente 0,39 mg/l IMPORTANTE : Tali soluzioni Standard di Calibrazione vanno preparate di volta in volta FASE 2 : Derivatizzazione Trasferire in una provetta di vetro da 10 ml con tappo a vite: Bianco Calibratore Campioni Acqua di grado HPLC 600 µl Soluzione di calibrazione da 0,39 mg/l 600 µl Campione 600 µl Reagente A Sol. Derivatizzante 600 µl 600 µl 600 µl Reagente B Sol. Tampone 1200 µl 1200 µl 1200 µl Al vortex per 10 secondi Release N 014 Esandione urinario frazione libera in Fluorimetria Giugno

4 Incubare a 70 C per 1 h Raffreddare N.B.: il campione così preparato è stabile 24 ore a 2-8 C FASE 3 : Condizionamento delle colonne di Clean-up Versare in colonna 2 ml di Reagente C Soluzione Condizionamento 1 Scartare l eluato Versare in colonna 2 ml di Reagente D Soluzione Condizionamento 2 Scartare l eluato FASE 4 : Caricamento del Calibratore e dei Campioni nelle colonne di Clean-up. Pipettare nelle rispettive colonne di Clean-up, il Calibratore ed i Campioni precedentemente preparati. Lasciar percolare lentamente al flusso di circa 1,0 ml/minuto tutto il liquido di ogni Colonna Clean-up, anche con l'ausilio di un vuoto moderato. Gettare il liquido percolato FASE 5 : Lavaggio delle colonne di Clean-up: Lavare con 6 ml di Reagente E Soluzione di Lavaggio Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria FASE 6 : Eluizione: Eluire con 600 µl di Reagente F Soluzione Eluente Raccogliere l eluato ed agitare al vortex FASE 7 : Prelevare 600 µl di eluato e aggiungere 500 µl di Acqua di grado HPLC (non fornita nel kit) Agitare accuratamente al Vortex INIEZIONE : Iniettare 100 µl nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Release N 014 Esandione urinario frazione libera in Fluorimetria Giugno

5 2,5 ESANDIONE URINARIO FREE - Avvertenze REAGENTE H : STANDARD CHIMICO / SOLUZIONE TEST 2,5 Esandione 3,90 mg/l PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO VARIAN λ Ex 273 nm λ Em 450 nm SENSIBILITA High TEMPO DI INTEGRAZIONE 4 o 8 PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ, è tassativo l uso del Metaguard - Guard Column (1 x 3 pz), cod. ZA600MG e del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz.) cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS 4,6 x 150 mm, 4 µ. Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20:80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,2 ml / minuto e scaricare i primi 30 ml. Per la determinazione del 2,5 Esandione Free NON è consigliato effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 20 : 80 v/v ) per 30 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 30 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP 100 µl Flusso di lavoro consigliato 1,6 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 100 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 5 o 6 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z05020 Standard chimico per 2,5 Esandione urinario 2 x 5 ml ZFM15960E Colonna Analitica Genesis C 18 (150 x 4,6mm -4 um) 1 PZ ZA600MG Metaguard Guard Column 1 x 3 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 PZ 5

6 2,5 ESANDIONE URINARIO FREE (Cromatogrammi di riferimento) Fig. 1 Soluzione Test Fig. 2 Standard di calibrazione in soluzione acquosa R.T ,5-Esandione R.T ,5-Esandione 0,39 mg/l 6

7 2,5 ESANDIONE URINARIO FREE (Cromatogrammi di riferimento) Fig. 3 Standard di calibrazione diluito Fig. 4 Campione urinario R.T ,5-Esandione 0,19 mg/l R.T ,5-Esandione 0,11 mg/l 7