Riassunto della presentazione dal titolo I mirna, lo sviluppo ontogenico e la trasformazione tumorale: nuovi meccanismi molecolari all opera

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1 Riassunto della presentazione dal titolo I mirna, lo sviluppo ontogenico e la trasformazione tumorale: nuovi meccanismi molecolari all opera 1- I microrna sono coinvolti in numerosi meccanismi molecolari fondamentali per il generale funzionamento delle cellule. Il meccanismo biosintetico classico che porta alla loro formazione, che è il più studiato e compreso finora, ha origine a livello del nucleo. Qui i meccanismi trascrizionali cellulari portano all espressione dei cosiddetti pri-mirna, che sono i trascritti primari di particolari geni che non codificano per alcuna proteina. Il complesso enzimatico multiproteico denominato microprocessore elabora questo trascritto primario, portando all escissione di una corta sequenza di RNA, in tutto o in parte avvolto in una doppia elica, che prende il nome di pre-mirna. I pre-mirna possiedono una corta sequenza a singolo filamento a una loro estremità, la quale viene riconosciuta da particolari sistemi di esporto nucleare comprendenti la GTPasi Ran e l esportina, grazie ai quali essi passano nel citoplasma. A questo punto, il complesso nucleasico comprendente l enzima Dicer elabora ulteriormente i pre-mirna portando finalmente alla formazione dei mirna maturi, che ora potranno assolvere alle loro funzioni inibitorie dell espressione genica, sia da soli che con l aiuto di ulteriori sistemi enzimatici. I mirna riconoscono e interagiscono con la porzione 3 UTR dei loro mrna bersaglio. 2- I mirna sono coinvolti, in C. elegans, nei meccanismi di sviluppo e morfogenesi corporea e nella corretta formazione dei pattern differenziativi cellulari. Nematodi portanti mutazioni temperatura-sensibili (ts) del mirna let-7, che è coinvolto nella inibizione traduzionale del gene let-60, muoiono a temperature non permissive a causa del bursting corporeo attraverso la vulva. Let-60 è l ortologo in C. elegans del gene Ras dei mammiferi. La spiegazione del fenotipo dei nematodi let-7 ts è che la mancata repressione di let-60 durante il passaggio all età adulta porta a malformazioni della struttura vulvale nel corso dello sviluppo corporeo, e quindi il corpo del nematode inizia a fuoriuscire dalla vulva stessa, provocando la morte dell animale. Mediante RNAi feeding contro let-60 si ripristina il fenotipo normale nei nematodi let-7 ts cresciuti a temperatura non permissiva. Il costrutto LacZ-3 UTR di let-60 permette di seguire l espressione del gene let-60 nel corso dello sviluppo dei nematodi. Let-60 è espresso ad alti livelli allo stadio embrionale e larvale, a livello della vulva in formazione, ma quando l animale entra nell età adulta l espressione di let-60 cala decisamente. Negli animali let-7 ts questa downregolazione di let-60 non avviene. 3- mir-84 è in C. elegans il mirna con la sequenza più omologa a let-7, ed è in grado anch esso di inibire l espressione di let-60. I costrutti mir-84-gfp e GFP60 (let-60-gfp) permettono di seguire l espressione di let-60 e di mir-84 a livello delle cellule progenitrici che vanno a formare la vulva. Nel corso dello sviluppo larvale, infatti, si instaurano pattern differenziativi a livello delle singole cellule, grazie all espressione diseguale di mir-84 e, di conseguenza, a differenze di espressione di let-60 fra le varie cellule adiacenti. L espressione di mir-84 è inversamente proporzionale a quella di let Come avviene la formazione di questo pattern differenziativi a livello di singole cellule? Si ipotizza che le cellule ancoranti (AC), poste subito dietro le cellule progenitrici vulvali, inviino segnali paracrini sotto forma della molecola lin-3 (ortologo di EGF), e che questo segnale abbia il suo massimo effetto sulla cellula chiamata p6.p, immediatamente adiacente ad essa, e minore sulle cellule adiacenti. Questo gradiente di segnalazione aiuterebbe a determinare le differenze fra le cellule progenitrici vulvali, ad esempio determinando le differenze di espressione del mirna let-7. Come conseguenza, nella cellula p6.p l espressione di let-60 è maggiore e quindi la cellula può rispondere meglio a lin-3 tramite la via di Ras-MAPK, attivando un determinato schema di differenziamento cellulare. Mutazioni gain of function in let-60, non contrastate dall overespressione di mir-84, portano

2 alla formazione di pseudovulve. Questo è dovuto probabilmente al fatto che in più di un distretto corporeo si vengono a formare foci di cellule progenitrici vulvali, a differenza di quanto accade negli animali WT. 5- Anche nel topo esistono diversi mirna specifici dello stadio embrionale. Sono stati isolati e clonati diversi mirna espressi solo nelle cellule staminali totipotenti della massa cellulare interna, allo stadio di blastocisti. Questi mirna, non appena le cellule embrionali entrano nella fase differenziativa sia in vitro che in vivo, spariscono dal citoplasma cellulare. Tali mirna vengono trascritti sotto forma di un'unica sequenza di pri-mirna, da cui si otterranno i singoli mirna funzionali. 6- L omologia di sequenza fra alcuni di questi mirna murini e i corrispondenti ortologhi nell uomo è elevata solo a livello delle porzioni realmente coinvolte nel silenziamento traduzionale dei geni-bersaglio. Queste porzioni presentano omologia di sequenza con porzioni della regione 3 UTR delle varie isoforme di Ras nel topo e nell uomo. Si può supporre quindi che il silenziamento di Ras ha un ruolo essenziale anche nelle fasi precoci della morfogenesi nel topo e nell uomo. 7- Trasfettando cellule del ceppo Hep-G2 con differenti quantità di pre-mirna let-7 si osserva la progressiva riduzione di Ras all interno di tali cellule. Viceversa, trasfettando le stesse cellule con sequenze nucleotidiche codificanti per RNA antisenso rivolte contro let-7, si osserva un marcato aumento nei livelli intracellulari di Ras. Questo avviene poiché le cellule esprimono fisiologicamente let-7, che ha come bersaglio il mrna codificante per Ras. 8- Nei tessuti tumorali ricavati da carcinomi polmonari umani, è possibile riscontrare una marcata diminuzione dei livelli intracellulari di let-7 rispetto ai normali livelli presenti all interno delle cellule circostanti non trasformate (NAT). In maniera inversamente proporzionale, i livelli intracellulari di Ras mostrano un marcato aumento, in accordo con il suo ruolo riconosciuto di oncogéne. 9- Come è facile immaginare, numerosi problemi pratici si frappongono alla realizzazione di terapie antitumorali basati sull RNAi e rivolte contro l oncogéne Ras. Fra gli altri, sono da sottolineare la multifattorialità tumorale e la varietà delle mutazioni trasformanti che possono colpire Ras, così come qualunque altro oncogène od oncosoppressore. Indubbiamente, però, la strada della repressione traduzionale di Ras mediante l RNAi è promettente e meriterebbe di essere indagata. 10- I mirna possono originarsi anche dalle sequenze introniche che, nel corso della maturazione nucleare dei trascritti primari degli mrna, vengono scartati dai meccanismi di splicing. Queste sequenze introniche possono funzionare come veri e propri precursori dei mirna, ed essere elaborati dai complessi catalitici in precedenza descritti. È stato ipotizzato che, in alcuni casi, questi mirna derivanti dagli introni vadano ad inibire la traduzione degli mrna maturi che derivano dal medesimo trascritto primario, offrendo così la possibilità di regolazione a feedback negativo dell espressione genica. 11- In definitiva, sono al momento ben conosciuti tre meccanismi mediante i quali viene attuato il silenziamento genico per mezzo di short RNAs: a partire da pseudogeni codificanti esclusivamente mirna e non sequenze aminoacidiche; a partire dalle sequenze introniche dei trascritti primari di geni codificanti per proteine e, nel caso dei sirna, in seguito alla trascrizione di sequenze gnomiche complementari, da cui si ottengono duplex ad RNA, successivamente processati dai consueti complessi multienzimatici (Dicer, ecc ). 12- Si è osservato che marcando radioattivamente un determinato mrna, di cui si sa esistere un meccanismo di silenziamento mediato da mirna, i frammenti radioattivi di questo mrna permangono nel nucleo per diversi giorni ed hanno una lunghezza di nucleotidi, ossia la lunghezza tipica dei mirna. Per spiegare questo fatto si sono fatte diverse ipotesi. Una in particolare prevede che i frammenti del mrna bersaglio funzionino da molecole mirnalike in grado di estendere e prolungare l effetto inibente indotto dai mirna primari. In alternativa, si è ipotizzato che le stesse sequenze di DNA genomico, codificanti per i

3 mirna, siano in grado di interagire con il mrna bersaglio facilitandone la degradazione da parte di meccanismi enzimatici ancora in tutto o in parte sconosciuti. I frammenti del mrna bersaglio sarebbero ancora una volta riciclati per prolungare il fenomeno del silenziamento traduzionale. Secondo questa ipotesi, quindi, la sequenza genomica codificante per un determinato mirna potrebbe funzionare da trappola per il mrna bersaglio.

4 Cristiano Gonella Scuola universitaria interfacoltà per le biotecnologie I mirna, lo sviluppo ontogenico e la trasformazione tumorale: nuovi meccanismi molecolari all opera Seminario di Biochimica- mirna

5 eccanismi generali di funzionamento dei mirna

6 Coinvolgimento dei mirna nei processi di sviluppo e organogenesi in C. elegans Let-7, let-60 (RNAi) Let-7

7 Specificazione tissutale dei pattern cellulari nel corso dello sviluppo della vulva mir-84 è l ortologo di let-7 con la maggiore omologia di sequenza

8 Attività di mir-84 sull espressione di let-60/ras nel corso della morfogenesi vulvare

9 ariazioni nell espressione di alcuni mirna nel corso delle prime fasi di sviluppo embrionale Northern blot cloni isolati da cellule ES murine

10 I mirna ritrovati in C. elegans e in M. musculus hanno numerosi paraloghi anche nell uomo Allineamento multiplo di mirna isolati da cellule ES murine e umane 3 -UTR del gene let60 in C. elegans, paralogia con Ras umana

11 Influenza di let-7 sull espressione di Ras in cellule umane

12 Variazioni nell espressione di let-7 in carcinomi polmonari umani

13 Nuovo, possibile approccio terapeutico!!! Si può pensare di ottenere in vivo la trasfezione stabile delle cellule tumorali per mezzo di vettori retrovirali. Il DNA introdotto nelle cellule trasformate codificherebbe per corte sequenze ribonucleotidiche complementari all mrna del oncogene bersaglio, in questo caso Ras (tecnologia dell RNAi). Numerosi problemi teorico-pratici!!!

14 enerazione di mirna intronici a partire da trascritti di geni codificanti proteine

15 tre meccanismi di silenziamento genico mediato da short RNAs

16 ipotesi del silenziamento genico mediato da introni

17 CONCLUSIONI i mirna sono coinvolti in un sempre maggior numero di meccanismi indirizzamento cellulare durante lo sviluppo degli organismi uricellulari. L inibizione traduzionale di geni come Ras o, ad es., dei ni omeotici è un modo molto efficiente e rapido di creare pattern di pressione genica tessuto-specifici. ata la loro funzione, i mirna possono giocare un ruolo fondamentale me oncogeni od oncosoppressori in svariati tumori umani. Al momento non si conoscono ancora appieno tutti i meccanismi molecolari utilizzati dai mirna per svolgere le loro funzioni nella cellula!!!