Immunodiagnostica e Diagnostica Molecolare attualità e prospettive. Prof.ssa Anna Onofri Liceo Scientifico «Iris Versari» Maggio 2015

Transcript

1 Immunodiagnostica e Diagnostica Molecolare attualità e prospettive Prof.ssa Anna Onofri Liceo Scientifico «Iris Versari» Maggio 2015

2

3 DATI INFORMAZIONE CONOSCENZA La Diagnostica di Laboratorio permette di trasformare i dati di laboratorio in informazioni utile dal punto di vista medico e quindi in conoscenza dello stato di salute del paziente

4 I test diagnostici in vitro (IVD) sono test non invasivi utilizzati su campioni biologici (ad esempio, su un campione di sangue, di urina o di tessuto) al fine di stabilire lo stato di salute di una persona DIAGNOSI Preclinica - Screening Clinica - MONITORAGGIO TERAPEUTICO Verifica livelli di efficacia farmaco Personalizzazione terapia VERIFICA GUARIGIONE Rientro dei valori negli intervalli di riferimento Impiego dei test diagnostici

5 I limiti : sensibilità e specificità La sensibilità di un test è la capacità del test di identificare i soggetti che presentano la malattia e corrisponde alla proporzione di soggetti realmente ammalati identificati come tali dal test. La specificità di un test è la capacità del test di identificare i soggetti che non presentano la malattia e corrisponde alla proporzione di soggetti realmente sani che sono identificati come tali dal test. Test molto sensibili sono poco specifici (possono più facilmente produrre falsi positivi). Viceversa, test molto specifici sono in generale poco sensibili (possono più facilmente produrre falsi negativi)

6 Evoluzione della Diagnostica di laboratorio

7 Seconda metà dell 800 «Rivoluzione batteriologica» Strumenti: termometro e sfigmomanometro (Riva- Rocci 1896), RX (Rontgen 1895). «identificazione chimica della malattia» Thudicum 1867: analisi qualitative (albumina, glucosio e urea nelle urine: , glicemia 1855 Fine 800: analisi quantitative «Il segno è il risultato di una misura e può essere espresso con un numero» Tra il 1883 e il 1895 nascono i primi Laboratori di Analisi Ospedalieri

8 La microbiologia medica è stata la scienza sperimentale che più ha influenzato la medicina, stimolando la nascita di nuovi ambiti di ricerca con importanti implicazioni pratiche, come l immunologia e la chimica farmaceutica. Inizi 1900 Evoluzione della batteriologia: lotta alla sifilide e alla tubercolosi (Pasteur, Koch, Fleming) Scoperta gruppi sanguigni (1900) e Rh (1940) Terapia antibiotica Metà 1900 Patologie metabolico-degenerative Anni 80 Virus HIV «Rivoluzione Terapeutica»

9

10 ASPETTATIVA DI VITA SVILUPPO DIAGNOSTICA

11 Diagnostica in vitro Ricerca in Fluidi Biologici Sangue Plasma Urine Liquor Di «una molecola» Proteine Acidi Nucleici Altro (Elementi/ altre Molecole) Immunodiagnostica Diagnostica Molecolare Chimica Clinica Connessa ad una patologia Ricerca di antigeni o anticorpi Infettivologia, Oncologia, Endocrinologia, Autoimmunità, Cardiologia, ecc Ricerca di Acidi Nucleici Infettivologia, Oncologia Ricerca, con reazioni Chimiche, di elettroliti, glucosio, colesterolo, enzimi, ecc

12 IMMUNODIAGNOSTICA Analisi Qualitativa e/o Quantitativa di Proteine (o altre molecole) nei fluidi biologici tramite reazioni antigene-anticorpo Gli analiti possono essere: ANTIGENI ANTICORPI Infettivologia: ricerca di anticorpi, IgG o IgM rivolti verso particolari antigeni batterici o virali Oncologia: ricerca di Antigeni tumore specifici (Marcatori Tumorali) Endocrinologia : ricerca di ormoni Autoimmunità: ricerca di antigeni o autoanticorpi Cardiologia : ricerca di antigeni cardiaci Screening Tossicologia Allergologia

13 IMMUNODIAGNOSTICA 1975: G. Köhler e C. Milstein mettono a punto la tecnica per produrre gli ANTICORPI MONOCLONALI (Nobel 1984) E stato così realizzato l'ideale degli immunologi, quello di poter produrre quantità illimitate di anticorpi identici con specificità predeterminata. specificità di legame la loro omogeneità l'illimitata possibilità di produzione.

14 ANTICORPI MONOCLONALI

15 Impiego degli Anticorpi Monoclonali DIAGNOSI TERAPIA Rendono la cellula più visibile al sistema immunitario Bloccano i fattori di crescita Impediscono la formazione di nuovi vasi Radioimmunoterapia

16 RICERCA ANTICORPI DIFFERENTE «LABELLING» ANTICORPO 125 I Enzima Fluoroforo Luminoforo RICERCA ANTIGENI

17 ANNI 80 : TECNICHE R.I.A. 1 risultato: 3-12h Throughput : 25test/h ANNI 90 : TECNICHE E.L.I.S.A. 1 risultato: 3-4 h Throughput : test/h ANNI 2000 : F.I.A./C.L.I.A. 1 risultato30-40 Throughput : 200 test/h

18 Qualche esempio la diagnostica dell HIV Le analisi per la diagnosi di HIV sono principalmente: 1. La ricerca degli anticorpi anti-hiv IgG/IgM (3 Gen) gp120/gp160/gp41 HIV1 gp 36, gp 105 HIV2 Test di 4 generazione «combo» HIV1/2 + ricerca ag p24 2. Il test di conferma o di Western Blot gp120/gp41/gp17/gp31/gp105/gp24/gp36 3. I test di biologia molecolare RNA virale (PCR real time) nel plasma DNA provirale nei linfociti 4. Il conteggio dei linfociti CD4 ("helper") e CD8 ("suppressor").

19 Anti HIV 2 Gen Anti HIV 3 Gen Western Blot TEST HIV 4 Gen «COMBO» Ab + Ag

20

21

22 Dicembre 2014 Test di screening (4 gen) con conferma dei positivi western blot Concentrazione di HIV RNA Virale ( anche come monitoraggio terapia), espressa in copie/ml ed effettuata con PCR. Neg < 50 copie/ml La Diagnostica Molecolare permette una diagnosi durante la fase finestra riducendo il numero di falsi negativi e riducendo il rischio di infezioni

23 La Diagnostica Molecolare si basa su una tecnologia che consente di diagnosticare uno stato clinico mediante la rilevazione di sequenze di RNA o DNA specifiche (gli acidi nucleici) nei fluidi biologici dei pazienti o nelle loro cellule patologiche. I principali settori di applicazione sono attualmente la MICROBIOLOGIA e l ONCOLOGIA DIAGNOSTICA MOLECOLARE

24 IMMUNODIAGNOSTICA ANTICORPI Le Parole Chiave DIAGNOSTICA MOLECOLARE DNA/RNA AMPLIFICAZIONE Il test di Diagnostica Molecolare viene eseguito mediante 3 fasi principali: 1. ESTRAZIONE : il reagente, specificamente creato in laboratorio, è in grado di estrarre DNA e RNA di virus e cellule tumorali di interesse; 2. AMPLIFICAZIONE: è il processo che permette di moltiplicare gli acidi nucleici precedentemente estratti, e consentire agli strumenti di leggere le molecole di DNA e RNA; 3. DIAGNOSI: una volta rilevato il virus o l agente tumorale nel fluido del paziente, lo strumento rileva le molecole anormali per ottenere la diagnosi.

25 Tecniche di Amplificazione L'amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni. P.C.R. REAL TIME P.C.R DNA Template dntp Primers Taq Pol Buffer Termociclatore Fasi post PCR: elettroforesi Qualitativa DNA Template dntp Primers Taq Pol Buffer Fluoroforo (Sybr-green) Termociclatore con lettore fluorescenza + SW dedicato Quantitativa

26 Real Time PCR : La Fluorescenza è proporzionale al prodotto di PCR ottenuto: Rilevamento della fluorescenza associata all amplificazione Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer Possibilità di analizzare molti campioni: automatizzabile Risultati molto rapidi : UN ESEMPIO CONCRETO

27 Il Sistema Genexpert GeneXpert è un sistema integrato che automatizza i tre processi necessari per eseguire una reazione di Real-Time PCR: RISPOSTA RAPIDA (ENTRO 60 ) CONTRO I DUE TRE GG DEI METODI COLTURALI. preparazione del campione amplificazione rilevamento della sequenza target. ANTRACE MRSA MICOBATTERIO TUBERCOLOSI ENTEROVIRUS Il modulo contiene i componenti necessari il controllo delle temperature di e un fluorimetro. La cartuccia (monouso) è costituita da camere di reazione dove sono contenuti i reagenti liofilizzati e i filtri necessari all estrazione. Il campione così preparato è spinto in un area della cartuccia dove avviene la reazione di amplificazione e il rilevamento del target.

28 Applicazioni in campo oncologico: ONCOLOGIA MOLECOLARE diagnosi precoci di alcuni tumori individuare stati di predisposizione ereditaria individuare micrometastasi e/o MMR (Malattia Minima Residua) individuare target prognostici individuare target predittivi di terapie mirate

29 Perché in un organismo si sviluppa un tumore? La proliferazione incontrollata delle cellule dipende da alterazioni dei geni, dette mutazioni. Alcune di queste mutazioni sono ereditarie, ma la maggior parte sono provocate da fattori esterni, indotti dai nostri comportamenti o dall'ambiente in cui viviamo. Occorre che gli errori si accumulino su diversi fronti perché il tumore possa cominciare a svilupparsi.

30 Quali tipi di Geni possono essere alla base del cancro? oncogéni (o geni oncògeni) geni oncosoppressori geni coinvolti nel cosiddetto "suicidio cellulare" (o apoptosi) geni implicati nei meccanismi di riparazione del DNA altri geni Studi degli ultimi anni hanno inoltre messo in rilievo l'importanza per la genesi del cancro di piccole molecole regolatorie dette microrna (mirna), frammenti di acidi nucleici che modulano l'espressione di diversi geni. Sommare l importanza del «microambiente»

31 TUMORI SOLIDI

32

33 ONCOEMATOLOGIA La Leucemia Mieloide Cronica (CML) è stata la prima neoplasia ematologica per cui si è riscontrata la correlazione con una anomalia citogenetico-molecolare, rappresentata dal cromosoma Philadelphia (Ph).

34 Dalla Diagnosi...alla Terapia

35 Nella diagnostica onco-ematologica le tecniche di biologia molecolare sono divenute di complemento alle tecniche di morfologia, immunologia e citogenetica. Le malattie nelle quali si applica di routine sono 1) le leucemie acute 2) la leucemia mieloide cronica 3) le malattie linfoproliferative croniche. L identificazione degli eventi molecolari di una patologia ematologica, permettono di: - definire differenti sottotipi di leucemia o linfoma con caratteristiche cliniche ben definite ed una prevedibile risposta alla terapia. - riconoscere il target (bersaglio) della lesione molecolare per indirizzare nuove terapie mirate (ad es. immunoterapia).

36 Microarray/Macroarray: chip innovativi! permette di esaminare in parallelo, in maniera veloce ed economica, l intero genoma di un organismo o la totalità dei suoi prodotti su una singola lastrina di vetro o di silicio, un chip. Gli array si basano sul principio che due filamenti di DNA a singola elica possono rinaturarsi quando riconoscono regioni complementari alla loro, formando molecole ibride.

37 I microarray sono usati principalmente in due ambiti tecnologici: (a) per determinare il profilo di espressione genica di un tessuto o un organismo, cioè misurare la quantità dei trascritti dei diversi geni espressi in un certo momento in un campione biologico; (b) per identificare la presenza di specifiche sequenze geniche e di alterazioni e mutazioni di geni in un campione biologico.

38 Il Sequenziamento genico: il futuro a portata di mano (Next generation sequencing, Ngs) Questa metodica consente di analizzare contemporaneamente tanti geni nello stesso individuo, abbattendo tempi e costi della diagnosi genetica; può addirittura permettere di analizzare l'intera porzione codificante del nostro genoma (praticamente tutti i nostri geni, cioè l''esoma') nei pazienti con malattia genetica che rimangono senza una diagnosi, così da arrivare a identificare il difetto molecolare alla base della loro patologia".

39 Il passato e il futuro del Sequenziamento

40 Cosa significa Sequenziare? DNA: Acido Desossiribonucleico Unità di base sono i Nucleotidi: A,T,C,G ESEMPIO LEGO LEGGO LEGO _EGO LEGO LAGO

41 la Next Generation Sequencing si caratterizza per: 1. Preparazione della sequencing library (frammentazione e immobilizzazione del DNA) 2. Amplificazione 3. Sequenziamento (per sintesi)

42 Il processo di semiconductor sequencing Le quattro basi vengono aggiunte una alla volta ai micropozzetti. Ogni volta che la TAQ polimerasi forma un legame fosfodiesterico viene rilasciato un protone. Il chip possiede un rilevatore sensibile ai cambiamenti di ph. 42

43 Next Generation Sequencing Il principale vantaggio è la possibilità tecnica di produrre un volume enorme di dati a costi estremamente più bassi ed in tempi estremamente più rapidi

44

45 Tariffario Regione Lombardia

46 Quale sequenziamento scegliere? 1. WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS) «lettura» dell intero genoma 2. EXOME SEQUENCING «lettura» limitata alle porzioni trascritte (<2%)

47 Che cosa permette di scoprire esattamente un test genetico tramite sequenziamento del genoma la diagnosi di malattie rare, laddove il gene sia già conosciuto; permette di calcolare il rischio genetico di alcune malattie complesse che una persona potrebbe sviluppare, quali il diabete o le malattie cardiovascolari. permette in alcuni casi di personalizzare la terapia di un paziente, somministrando i farmaci giusti nella maniera più mirata Ormai è di moda parlare di lettura del DNA. Ci sono i limiti o i rischi correlati? Per alcune malattie genetiche sono note le mutazioni responsabili della patologia e il numero continua ad aumentare. Nel caso delle malattie complesse sono l ambiente (dieta, stile di vita, qualità dell aria, ecc.) e il genoma a contribuire, entrambi, allo sviluppo di una malattia. Quindi la propensione, rilevata tramite un test genetico, per una malattia complessa va interpretata come un avviso e non come una diagnosi. Ci sono altri centri in Italia che sequenziano il DNA? Sì, a Milano, Verona, Udine e Cagliari Quanto costa sequenziare il genoma? Intorno agli Ci sono inoltre test specifici (per esempio il sequenziamento del solo esoma, cioè dei geni contenuti nel genoma) che costano già meno di Può un privato cittadino chiedere la lettura completa del suo DNA? Sì, in Italia esistono centri specializzati che permettono l analisi/sequenziamento del genoma umano per conoscere il proprio patrimonio genetico, indipendentemente da specifiche patologie, Al momento al San Raffaele è possibile richiederlo solo per diagnosi, tramite impegnativa del medico curante o medico genetista. Quanto tempo si impiega? Circa 90 giorni. La lettura del DNA in sé dura 10 giorni ma ci sono i tempi di estrazione e preparazione del DNA prima dell avvio della lettura e successivamente i tempi legati all analisi e interpretazione dei dati.

48 Le prospettive: la FARMACOGENOMICA La farmacogenomica (spesso chiamata anche farmacogenetica) è una disciplina che studia l'interazione fra genetica e farmaco. scopo principale è quello di caratterizzare varianti genetiche (dette anche marcatori farmacogenomici o farmacogenetici) al fine di supportare il medico (1) nella scelta del farmaco e (2) nell aggiustamento della dose. La farmacogenomica è parte della cosiddetta medicina personalizzata

49 La personalizzazione della Terapia: Tailored Therapy

50

51

52 Grazie