ANALISI DEI GENI ICOSL FOXP3 e ICOS, IN PAZIENTI AFFETTI DA ALOPECIA AREATA

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1 ANALISI DEI GENI ICOSL FOXP3 e ICOS, IN PAZIENTI AFFETTI DA ALOPECIA AREATA L alopecia areata (AA) è una comune malattia della pelle che si manifesta con la perdita dei capelli e affligge approssimativamente l 1-2% della popolazione generale. L eziopatologia dell Alopecia non è ancora ben compresa. L Alopecia è una patologia autoimmune tessuto-specifica diretta contro il follicolo del capello e potrebbe essere associata con altre malattie autoimmuni. Il meccanismo di disfunzione del follicolo è immunologico ed è controllato da linfociti T attivati. Vari geni responsabili della risposta immunitaria si considerano implicati nello sviluppo dell Alopecia. In questo studio sono stati presi in considerazione i geni responsabili del differenziamento e della funzionalità dei T regolatori (Tregs): FOXP3, ICOSL, ICOS

2 IMMUNE SYSTEM Infiammation Tolerance Effectors Regulators

3 Le cellule T regolatorie (Treg), mediano la soppressione immunitaria per controllare non favorevoli risposte immuni contro antigeni-self o patogeni. I geni ICOSL, ICOS e FOXP3 sono coinvolti nella risposta immunitaria, inducendo l attivazione e la maturazione delle cellule T regolatorie CD4+CD25+FOXP3+CD127 -.

4 Molti studi mostrano che i linfociti T CD4+ e CD8+ hanno un ruolo chiave durante lo sviluppo dell alopecia areata (AA). Comunque, non può essere ingnorato il ruolo che ha una significativa riduzione di cellule T regolatorie CD4 + CD25 + T cells nell incidenza dell AA. Sono stati recentemente osservate delle deficienze nel repertorio di linfociti T regolatori CD4+ CD25+, in topi C3H/HeJ con AA. L importanza delle T regolatorie è dimostrata dal fatto che topi timectomizzati tre giorni dopo la nascita sviluppano una malattie autoimmune contro diversi organi, inoltre lo sviluppo della patologia autoimmune viene prevenuta dall iniezione di CD4+ CD25+T cells nei topi.

5 FOXp3, ICOSL e Alopecia Areata FOXP3 è espresso principalmente nelle cellule T regolatorie (Treg). L espressione del fattore di trascrizione Foxp3 ha un importanza significativa nella maturazione, nello sviluppo e nell inibizione della funzione dei T reg. FOXP3 è inoltre coinvolto nella regolazione dell espressione di alcune citochine, può inibire l espressione di citochine come IL-2, IL-4, IFN-γ, le quali insieme ai Treg interpretano un ruolo importante nello sviluppo dell Alopecia. Pertanto si può dedurre che lo stato di espressione del gene FOXP3 possa essere coinvolto nella patologia dell Alopecia

6 Impaired inhibitory function of circulating CD4+CD25+ regulatory T cells in alopecia areata 1CD4+CD25+Foxp3+ T cell counts (a) and Treg functional ratio (b) in total AA patients and controls (Mann Whitney U-test. *P < 0.05). CD4+CD25+Foxp3+ T cell counts (c) and Treg functional ratio (d) in each of the three types of AA and controls (Dunnett s test). Treg functional ratio = (1 proliferative response of CD4+CD25 T cells with CD4+CD25+ T cells/proliferative response of CD4+CD25 T cells without CD4+CD25+ T cells) 100 (%) Questo dato dimostra che lo stato di attività della malattia è correlata al decremento della funzione inibitoria dei Treg

7 % di CD3+ CD4+ CD25+ FOXP3+ nel sangue periferico Cells % 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Pazienti Controlli sani La percentuale di Tregs non varia nei pazienti rispetto ai controlli sani

8 Analisi genetiche effettuate Sono stati effettuati saggi di PCR e di sequenziamento diretto per analizzare la sequenza dei geni FOXP3, ICOS e ICOSLG L espressione genica di FOXP3, ICOS e ICOSLG nelle cellule linfocitarie è stata determinata da esperimenti di real Time PCR

9 Single nucleotide polymorphisms in the promoter regions of Foxp3 and ICOSL genes are associated with Alopecia Areata. In questo studio, sono stati reclutati in Italia 120 pazienti affetti da Alopecia Totale, Universale e Patchy, sono stati confrontati con 80 soggetti sani di controllo dello stesso sesso della stessa età e della stessa origine etnica per analizzare i siti polimorfici dei geni FOXP3 ICOSLG e per comprendere se i polimorfismi di questi geni siano associati con lo sviluppo della patologia

10 Caratteristiche dei pazienti partecipanti Alopecia Totale Alopecia Universale Alopecia Patchy età 9(< 30 anni) 22 (>30 anni) 29 (< 30 anni) 22 (>30 anni) 25 (< 30 anni) 21 (>30 anni) sesso 22 femmine 9 maschio 43 femmine 8 maschi 32 femmine 14 maschi regione 1 Piemonte 3 Liguria 1 Puglia 26 Lazio 1 Piemonte 1 Lombardia 8 Liguria 1 Puglia 1 Marche 1 Emilia Romania 2 Veneto 1 Friuli 35 Lazio 1 Veneto 45 Lazio

11 SNP analizzati LOCALIZZAZIONE SOSTITUZIONE NUCLEOTIDICA FREQUENZE ALLELICHE NEI PAZIENTI CON ALOPECIA FREQUENZE ALLELICHE NEI SANI P value Promotore ICOSL rs378299(c T) 0,3 0,1 P<0,01 Promotore FOXP3 rs (a G) 0,4 0,05 P<0,001 UTR3 ICOS rs (T C) 0,2 0,1 P<0,05 UTR3 ICOS rs (c T) 0,015 0,01 P>0,05 UTR3 ICOS rs (a G) 0 0 P>0,05 UTR3 ICOS rs (c T) 0,03 0 P>0,05 UTR3 ICOS rs (a G) 0,06 0,05 P>0,05 UTR3 ICOS rs (g C) 0,3 0,1 P<0,01

12 ICOSLG gene expression FOXP3 gene expression Livello di espressione genica di FOXP3 e ICOSL nei pazienti affetti da Alopecia (barre bianche) rispetto ai soggetti sani (barre nere) Ct Value :10-15 Ct Value :16-24 I valori di Ct identificano il numero di cicli di amplificazione necessari per raggiungere un livello di espressione genica soglia. Sono stati identificati 2 range di espressione: per FOXP ct= alta espressione ct= bassa espressione per ICOSL ct= alta espressione ct= bassa espressione Ct Value :16-20 Ct Value :21-26 Nei pazienti l espressione dei due geni FOXP3 e ICOSL risulta più bassa paragonata al grado di espressione nei controlli sani

13 Meccanismo di funzione dei microrna Differentiation*: Double Negative (CD4-/CD8-): let-7d-5p, let-7e-5p, mir-126-3p, mir-128, mir- 146b-5p, mir-15a-5p, mir-17-5p, mir-17-3p, mir-181c-5p, mir20b Double Positive (CD4+/CD8+): let-7b-5p, mir-181a-5p, mir-181b-5p, mir-181d, mir- 19b-3p. CD4+ Naïve: mir-132-3p, mir-146a-5p, mir-182-5p, mir-184, mir-25-3p, mir-326, mir-92a-3p. CD8+ Naïve: let-7a-5p, let-7c, let-7f-5p, let-7g-5p, mir-130b-3p, mir-139-5p, mir-142-3p, mir-150-5p, mir-155-5p, mir-15a-3p, Differentially Expressed in Tregs: mir-100-5p, mir-125b-5p, mir-146a-5p, mir-181c-5p, mir-20b-5p, mir-21-5p, mir-31-5p, mir-335-5p, mir-365a-3p, mir-99a-5p. T-Cell Activation: let-7e-5p, let-7g-5p, let-7i-5p, mir-106b-5p, mir-139-5p, mir-142-5p, mir-146a-5p, mir-146b-5p, mir-155-5p, mir-15a-5p, mir-15a-3p, mir-181a-5p, mir- 181c-5p, mir-195-5p, mir-20b-5p, mir-214-3p, mir-223-3p, mir-23a-3p, mir-23b-3p, mir-25-3p,

14 H.R. Goodarzi et al,. British Journal of Dermatology, 2012,166: È stata trovata una upregolazione di mir- 221, mir-125b, mir-106a and mir-410 nelle cellule del bulbo pilifero dei pazienti con Alopecia Di Yu et al., Nature,2007;450: Roquin è una ubiquitina E3 ligasi poco conosciuta, ma ha un ruolo essenziale nel prevenire malattie autoimmuni T-cell mediata e nella regolazione dell omeostasi dell mrna di ICOS e nella degradazione indotta dai micrornas Il dominio N-terminale di Roquin lega l mrna di ICOS in corrispondenza della regione 3'-untranslated (UTR3 ) adiacente alla sequenza riconosciuta dal microrna mir101, inducendone la degradazione

15 Alcuni single nucleotide polymorphisms (SNPs) localizzati nella regione 3' UTR del gene ICOS, possono reagire con dei micrornas (mirnas). I mirnas sono una classe di piccole molecole regolatorie noncodificanti che controllano l'espressione genica a livello posttrascrizionale. L'alterata funzionalità dei mirna affligge una varietà di processi biologici coinvolti nell'eziopatologia di diverse patologie mendeliane e complesse. Perciò è predittivo pensare che l'espressione e funzione aberrante di alcuni mirna potrebbe contribuire allo sviluppo dell' Alopecia Areata.

16

17 La presenza di uno o più SNPs nella regione UTR3' del gene ICOS può aumentare o ridurre il grado di affinità della sequenza target del gene con i microrna

18 mir 369 e mir27b legano la regione UTR3' di ICOS rispettivamente in corrispondenza degli SNPs rs e rs

19 mir101 e mir103 legano una sequenza nell UTR3 di ICOS a valle dello SNP rs (g C)

20 Analisi d espressione dei mirna che regolano il gene ICOS nel sangue periferico dei pazienti con AA rispetto ai soggetti sani Il valore medio di Ct per i controlli è molto più bassa che nei pazienti

21 CITOCHERATINA 17 Allo scopo di individuare gli antigeni self responsabili della risposta immune contro il follicolo del capello lo studio si concentra anche sull analisi della citocheratina 17 (K17). La citocheratina 17 è una proteina filamentosa essenziale per il mantenimento della citoarchitettura delle cellule epiteliali ed è epressa nel follicolo del capello. Mutazioni nel gene della citocheratina 17 sono associate a un disordine ectodermico congenito di tipo II K17 è colocalizzata a livello citoplasmatico con la proteina AIRE (autoimmune regulator gene)nelle cellule del follicolo del capello. AIRE è espressa principalmente nel timo dove regola la selezione negativa dei linfociti T self reattivi. Questa co-localizzazione è di notevole interesse in quanto fa ipotizzare che la citocheratina 17 possa essere uno degli antigeni tessuto specifici regolati da AIRE e che pertanto AIRE possa regolare il repertorio dei linfociti T K17 autoreattivi a livello timico.

22 Risultati preliminari LOCALIZZAZIONE SOSTITUZIONE NUCLEOTIDICA FREQUENZE ALLELICHE NEI PAZIENTI CON ALOPECIA UTR3 KRT17 rs (c A) 0,01 0 FREQUENZE ALLELICHE NEI SANI UTR3 KRT17 rs (c T) 0,015 0,01 UTR3 KRT17 rs (c T) 0 0 UTR3 KRT17 rs (c T) 0 0

23 Sviluppi futuri Studi funzionali dei polimorfismi analizzati, per comprendere la loro influenza sullo sviluppo e l'attivazione dei T regolatori e la loro importanza dal punto di vista clinico per la diagnostica e la terapia dell Alopecia.

24 Associazione ANAA Università di Genova CEBR-Centro di Eccellenza per la Ricerca Biomedica Prof. F. Indiveri Prof. G. Filaci Università di Roma La sapienza Prof. A. Rossi Dott.ssa F. Megiorni Prof. A. Pizzuti

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