TRASPORTO DI MEMBRANA

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1 TRASPORTO DI MEMBRANA movimento di molecole e ioni tra i diversi scomparti presenti nei sistemi biologici è noto come TRASPORTO, esso può essere considerato fra singole membrane cellulari, fra una pianta e il suo ambiente circostante o fra una parte e l altra della pianta

2 Il movimento di molecole per diffusione è definito TRASPORTO PASSIVO Il movimento di sostanze contro un gradiente di concentrazione, o chimico, è definito TRASPORTO ATTIVO, non è spontaneo e necessita che venga compiuto del lavoro sul sistema tramite l applicazione di energia cellulare. Un modo per ottenere questo risultato è di accoppiare il trasporto con l idrolisi di ATP

3 membrana cellulare Permette o impedisce il movimento di una sostanza (permeabilità di membrana) garantisce un ambiente fisico-chimico altamente stabile condizioni indispensabile al regolare svolgimento di attività metaboliche, riproduttive e dello sviluppo

4 eucarioti evoluzione dello sviluppo endomembrane concentrazione reagenti separazione processi incompatibili accumulo cataboliti necessità di controllare la composizione dell ambiente interno in funzione a diverse condizioni ambientali (mantenimento dell omeostasi cellulare)

5 PIANTE il trasporto di membrana è alla base di numerosi processi biologici essenziali La genesi del turgore cellulare L acquisizione di nutrienti La secrezione di prodotti di rifiuto del metabolismo Distribuzione di metaboliti La compartimentalizzazione dei metaboliti La trasduzione dell energia La trasduzione del segnale

6 generazione del turgore. La presenza della parete cellulare permette alle cellule di generare turgore (pressione positiva) accumulo K + nel citoplasma e nel vacuolo In base al principio dell elettroneutralità delle soluzioni i cationi devono essere controbilanciati da una corrispondente concentrazioni di anioni; gli anioni principali che si accumulano nel vacuolo sono il Cl - ( in funzione alla sua disponibilità ) o il malato

7 ACQUISIZIONE NUTRIENTI Le piante, a differenza degli animali, sintetizzano biomolecole organiche a partire da nutrienti inorganici. Molti di questi elementi essenziali, per essere assimilati negli amminoacidi o altri metaboliti, sono assorbiti dal suolo grazie a specifici sistemi di trasporto attraverso le radici

8 ESCREZIONE PRODOTTI DI SCARTO Il metabolismo genera inevitabilmente molecole di scarto inutilizzabili che devono essere rimosse dal citosol. L H + è il principale prodotto generato dal metabolismo Per espellere i protoni dal citosol sulla membrana plasmatica e su quella vacuolare delle cellule vegetali si sono evolute le cosiddette pompe protoniche

9 DISTRIBUZIONE METABOLITI Ripartizione prodotti della fotosintesi dai siti di sintesi a quelli di utilizzo e di accumulo

10 COMPARTIMENTALIZZAZIONE DEI METABOLITI Alcuni processi biochimici sono incompatibili tra loro necessità di evitare cicli futili (ex. sintesi amido e glicolisi)

11 TRASFORMAZIONE ENERGIA Il trasporto di membrana è al centro dei processi che realizzano la conversione dell energia libera in forme biologicamente utili fotosintesi e respirazione

12 TRASDUZIONE DEL SEGNALE Molti segnali biotici o abiotici implicati nello sviluppo e nella crescita inducono nelle piante risposte cellulari innescate da aumenti transienti della concentrazione citosolica del Ca 2 2+ libero stimolo ambientale [Ca 2 2+ ] risposta fisiologica

13 DIFFUSIONE spostamento delle molecole secondo un gradiente di concentrazione dovuto ad agitazione termica casuale

14 Il verso del movimento netto di un soluto attraverso una membrana è stabilito dal verso della forza motrice che agisce sul sistema di trasporto. Le forze motrici possono essere quantificate in termini di relazioni di energia libera connessa ai potenziali chimici del soluto

15 Il potenziale chimico di un soluto non carico, j, presente in un mezzo può essere definito dall equazione: µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P

16 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P potenziale chimico di j in condizioni standard

17 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P componente della concentrazione

18 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P componente della carica elettrostatica

19 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P componente della pressione idrostatica

20 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P costante universale dei gas

21 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P temperatura assoluta

22 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P concentrazione di j

23 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P carica elettrostatica di j

24 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P costante di Faraday

25 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P potenziale elettrico generale della soluzione

26 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P volume parziale molale j

27 µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P pressione

28 X µ j = µ * j + RTln C j + z j FE + V j P significativo esclusivamente nei movimenti osmotici dell acqua

29 L importanza del concetto del potenziale chimico è che somma tutte le forze che possono agire su una molecola e che portano al trasporto netto In generale, la diffusione ( o trasporto passivo) muove sempre le molecole da zone a potenziale chimico superiore verso aree con potenziale chimico minore. Il movimento contro gradiente di potenziale chimico indica un trasporto attivo

30 saccarosio µ i s = µ* s + RTln Ci s µ o s = µ* s + RTln Co s i = interno O = esterno

31 Possiamo calcolare la differenza del potenziale chimico del saccarosio fra le soluzioni all interno e all esterno della cellula indipendentemente dal meccanismo di trasporto

32 Forza motrice Δµ s = µ o s - µi s = = (µ * s + RTln Co s ) - (µ* s + RTln Ci s ) = = RT(ln C o s - ln Ci s ) = = RT ln C o s C i s

33 Δµ s = RT ln C o s C i s Δµ s è proporzionale al gradiente di concentrazione

34 relazione tra il potenziale chimico µ e il trasporto di molecole attraverso una membrana

35 ione K + (Bisogna considerare la componente elettrica del potenziale chimico) C o K Δµ K = RT ln + zf(e o -E i ) C i K dato che la carica elettrostatica del K + z=+1 C o K Δµ K = RT ln + F(E o -E i ) C i K Potenziale elettrico

36 gli ioni diffondono sia in risposta ai loro gradienti di concentrazione che a qualsiasi differenza di potenziale elettrico, se viene applicato un voltaggio (un campo elettrico) fra i due scomparti gli ioni possono essere condotti contro un gradiente di concentrazione

37 cosa succede se una membrana ha una permeabilità maggiore per il K + che per il Cl -? I due ioni diffonderanno attraverso la membrana a velocità diversa. Il risultato sarà una debole separazione di cariche che genererà un potenziale elettrico attraverso la membrana. Il potenziale di membrana che si forma è detto potenziale di diffusione

38 il potenziale di diffusione ritarda l ingresso di K + e accelera quello di Cl -

39 PRINCIPIO DELL ELETTRONEUTRALITÀ una soluzione contiene sempre un numero uguale di anioni e cationi la presenza di un potenziale di membrana indica una distribuzione disuguale degli ioni attraverso la membrana trascurabile in termini chimici -100 mv un anione in più su

40 cosa succede se la membrana è permeabile solo al K +? all equilibrio [K + ] B > [Cl - ] B all equilibrio si genera un: POTENZIALE DI MEMBRANA che bilancia il GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE

41 quando la distribuzione di un soluto attraverso la membrana raggiunge l equilibrio, il flusso passivo (J) (cioè la quantità di soluto che attraversa un unità di area di membrana nell unità di tempo) è lo stesso in entrambe le direzioni J o i = J i o

42 J o i = J i o i potenziali elettrochimici saranno uguali µ j o = µ j i quindi per ogni ione µ * j + RTln C j o + z j FE o = µ * j + RTln C j i + z j FE i risolvendo l equazione si ottiene la differenza del potenziale elettrico fra i due scomparti E i -E o = RT z j F ln C j o C j i equazione di Nerst

43 La differenza di potenziale elettrico è conosciuta come il potenziale di Nerst ΔE n = E i -E o ΔE n = 2.3RT z j F log C j o C j i per uno ione univalente a 25 C ΔE n = 59 log C j o C j i

44 all equilibrio, la differenza di concentrazione di uno ione tra due scomparti è bilanciata dalla differenza di voltaggio tra gli scomparti ΔE n =59 log C j o C j i stabilendo un ΔE di 59 mv mantiene una differenza di concentrazione di 10 volte per uno ione che viene trasportato tramite diffusione passiva Co/Ci=10/1 log 10=1

45 tutte le cellule possiedono un potenziale di membrana, dovuto alla distribuzione asimmetrica tra l interno e l esterno della cellula. Questi potenziali di membrana possono essere facilmente determinati inserendo un microelettrodo in una cellula e misurando la differenza di voltaggio fra l interno della cellula e il mezzo esterno in cui la cellula è immersa -240 mv < ΔE n > -60 mv

46 Trasporto passivo = frecce tratteggiate Trasporto attivo = frecce intere

47 EQUAZIONE DI GOLDMAN Numerosi ioni permeano simultaneamente le membrane cellulari; quindi il potenziale di Nerst per ogni singola specie ionica descrive raramente il potenziale di diffusione della membrana. Invece tutti i potenziali di diffusione attraverso la membrana sono descritti dall equazione di Goldman

48 Nelle piante i potenziali di membrana misurati sperimentalmente sono spesso molto più negativi di quelli calcolati dall equazione di Goldman ΔE con equazione di Goldman misura sperimentale ΔE = -50/-40 mv = -240/-60 mv Oltre al potenziale di diffusione, esiste una seconda componente del potenziale di membrana. L eccesso di voltaggio è dato dalla H + -ATPasi elettrogenica della membrana plasmatica. Si genera un voltaggio attraverso la membrana ogni qualvolta uno ione si sposta dentro o fuori dalla cellula senza essere controbilanciato da uno ione di carica opposta. Tale meccanismo di trasporto attivo, definito POMPA ELETTROGENICA, che tenderà a spostare il potenziale di membrana lontano rispetto al valore previsto dall equazione di Goldman

49 L energia richiesta per il trasporto attivo è spesso fornita dall idrolisi dell ATP. La dipendenza del potenziale di membrana dall ATP può essere dimostrata osservando l effetto del cianuro sul potenziale di membrana

50 Due tipi di trasportatori aumentano il movimento di soluti attraverso la membrana: Canali sono delle proteine transmembrana che fungono da pori selettivi nella membrana Carrier la sostanza che viene trasportata è inizialmente legata da un sito attivo posto sul carrier proteico. Il legame porta a un cambiamento conformazionale della proteina, che espone la sostanza alla soluzione dalla parte opposta della membrana.

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52 CANALI può non richiedere il legame del soluto due conformazioni: aperti/chiusi, è un trasporto passivo Tipo R attivati rapidamente si aprono e si chiudono molto rapidamente in risposta ad un voltaggio fornito come stimolo Tipo-S attivati lentamente, rimanendo aperti per tutta la durata dello stimolo

53 Modello del canale per il potassio nelle piante

54 Patch clamp permette di rilevare delle piccole correnti elettriche costituite dal flusso di ioni attraverso i canali. L a c a r a t t e r i s t i c a è l a possibilità di analizzare u n a s i n g o l a m o l e c o l a proteica durante la sua attività di catalisi del movimento ionico

55 voltage-clamp misura la corrente elettrica e i potenziali di membrana che vengono applicati dall esterno ad una membrana e quindi all apertura di un numero crescente di canali in risposta ai potenziali applicati

56 CARRIER trasporto passivo (diffusione facilitata) trasporto vettoriale ioni e soluti attraverso le membrane

57 Il meccanismo proposto non prevede un movimento dei siti di legame del soluto da un lato all altro della membrana, ma piuttosto che la reazione di trasporto sia conseguente a variazioni conformazionali del carrier la velocità di trasporto è più lenta rispetto ai canali (V canale = 10 6 V carrier )

58 le cinetiche di attività dei carrier sono descrivibili con l equazione di Michaelis-Menten La concentrazione di substrato che determina una velocità di trasporto corrisponde alla metà della velocità massima rappresenta la costante di Michaelis-Menten

59 PRINCIPALI IONI E SOLUTI TRASPORTATI DA CARRIER NH 4+, NO 3-, P i, SO 4 2-, zuccheri, amminoacidi, basi azotate alta selettività per la molecola da trasportare

60 TRASPORTO ATTIVO PRIMARIO il trasporto è accoppiato a una fonte di energia metabolica idrolisi di ATP una reazione di ossidoriduzione Le proteine di membrana responsabili del trasporto attivo primario sono definite pompe POMPE elettrogeniche H + -ATPasi è riferito al trasporto di ioni che coinvolge il movimento netto di carica attraverso la membrana elettroneutre H + /K + -ATPasi (animali) Na + /K + -ATPasi (animali) non coinvolge il movimento netto di carica

61 principali pompe elettrogeniche H + -ATPasi di plasmalemma H + -ATPasi vacuolare H + -pirofosfatasi (vacuolo e golgi)

62 H + -ATPasi di plasmalemma Regione idrofilica Acido aspartico che subisce fosforilazione Il domino C-Terminale è autoinibitorio

63 H + -ATPasi vacuolare Questa proteina può essere separata in una porzione solubile definita V 1, che comprende i siti di legame dei nucleotidi adenilici, e una porzione integrale di membrana definita V 0, che costituisce la struttura attraverso la quale gli ioni H + permeano la membrana. Nella porzione V 1 tre copie della subunità 1 e della subunità 2 si dispongono a formare una struttura esamerica; più o meno altre 8 subunità contribuiscono alla costituzione di V 1. La porzione V 0 contiene copie multiple della subunità 3 e quattro altre subunità.

64 estrusione attiva di H + gradiente elettrochimico di protoni (forza motrice protonica) ENERGIA LIBERA

65 il movimento di protoni secondo il loro gradiente elettrochimico può essere accoppiato al lavoro cellulare Δµ H + = FΔE + 2.3RT log [H+ ] i [H + ] o Δµ Δp = = ΔE + 2.3RT log [H+ ] i H + F F [H + ] o

66 poiché ph = -log[h + ] log [H+ ] i [H + ] o =- (ph i -ph o )= ΔpH Δp = ΔE - 2.3RT F ΔpH Δp = ΔE -59 ΔpH Forza proton motrice è l energia libera accumulata sotto forma di gradiente di H +

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68 L insieme dei processi chemiosmotici che si realizzano nell ambito di una cellula vegetale L energia accumulata nei mitocondri e nei cloroplasti sotto forma di gradiente protonico è utilizzata per sintetizzare ATP. L attività di particolari pompe che idrolizzano ATP genera gradienti protonici attraverso la membrana plasmatica o il tonoplasto. I potenziali elettrochimici stabiliti dall attività di queste pompe sono utilizzati per muovere ioni o metaboliti.

69 TRASPORTO ATTIVO SECONDARIO la forza proton motrice può guidare il trasporto di altre sostanze contro il gradiente elettrochimico SIMPORTO protone e molecola si muovono nella stessa direzione ANTIPORTO protone e molecola si muovono in direzioni opposte

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71 L energia che garantisce lo svolgimento del processo è accumulata tramite il gradiente di protoni viene utilizzata per assorbire il substrato contro il suo gradiente di concentrazione

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73 simporto glucosio-h + L aumento osservabile di ph indica che i protoni sono scomparsi dal liquido e che allo stesso tempo diminuisce il potenziale di membrana della cellula

74 Le proprietà di trasporto di un soluto possono cambiare a diverse concentrazioni del soluto A basse concentrazioni di saccarosio la velocità di assorbimento del saccarosio mostra cinetiche di saturazione t i p i c h e d i u n a m o l e c o l a trasportatrice simporto H + -saccarosio alte concentrazioni saccarosio, la velocità di assorbimento aumenta linearmente trasporto passivo

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76 Studi molecolari e biochimici hanno confermato la presenza di canali dell acqua nelle membrane delle cellule vegetali. Questi canali, sono definiti acquaporine

77 Le acquaporine Sono membri della famiglia dei canali transmembrana conosciuta come major intrinsic protein (MIP) hanno dimensioni piuttosto limitate (25-30 kda), presentano 6 regioni transmembrana e possiedono una sequenza interna ripetuta indicativa della loro origine da un gene che ha subito fenomeni di duplicazione e fusione. Le acquaporine sono caratterizzate anche da residui NPA (Asn-Pro- Ala) altamente conservati sia nella metà N- sia in quella C- terminale della proteina. Nelle piante sono state identificate acquaporine sulle membrane vacuolari e su quelle plasmatiche ed è quindi possibile definire due subfamiglie:quella delle proteine integrali del tonoplasto (TIP) e quella delle proteine integrali della membrana plasmatica (PIP)

78 ATP sintasi CF 1 porzione estrinseca che contiene il sito catalitico coinvolto nella sintesi di ATP α 3, β 3, γ, δ, ε CF 0 porzione proteica integrata alla membrana che funziona da canale per i protoni a, b, b, c 12 Altamente idrofobica

79 H + -ATPasi F-ATPasi dei mitocondri e dei cloroplasti. V-ATPasi, presente nel tonoplasto. Pompa i protoni all interno del vacuolo, generando la forza motrice per diversi sistemi di trasporto P-ATPasi, presente sulla membrana plasmatica

80 RUOLO FISIOLOGICO DELL H + -ATPasi DI PLASMALEMMA mantenimento del ph del citoplasma ph interruzione della dormienza dei semi ph sintesi DNA e divisione cellulare ph risposte di difesa a patogeni

81 RUOLO FISIOLOGICO DELL H + -ATPasi DI PLASMALEMMA forza guida per sistemi di trasporto di ioni e nutrienti

82 RUOLO FISIOLOGICO DELL H + -ATPasi DI PLASMALEMMA apertura e chiusura degli stomi

83 RUOLO FISIOLOGICO DELL H + -ATPasi DI PLASMALEMMA crescita per distensione H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H + H +

84 possibili meccanismi che determinano un aumento di attività dell H + -ATPasi fattori che influenzano l attività dell H + -ATPasi stress salino luce auxina patogeni

85 il dominio C-terminale regola l attività dell enzima prove sperimentali espressione H + -ATPasi senza C terminale proteolisi incontrollata

86 LA FUSICOCCINA metabolita fitotossico prodotto dal fungo Fusicoccum amygdali l infezione provoca una stimolazione incontrollata dell H + -ATPasi Il dominio C-terminale non è più in grado di controllare l attività dell H + ATPasi apertura incontrollata degli stomi morte per avvizzimento

87 la fusicoccina promuove il legame di una proteina sul dominio C-terminale dell H + -ATPasi Proteine Classe di proteine regolatrici diffuse in tutti gli eucarioti Proteine dimeriche. Ogni monomero ha un PM di circa 30 kda Interagiscono con numerose proteine bersaglio, tramite il riconoscimento di particolari sequenze fosforilate su residui di serina

88 Ruolo delle Regolazione dell H + ATPasi - Regolazione della trascrizione genica - Regolazione dell H + sintasi - Processo apoptotico?

89 meccanismo di azione della fusicoccina bassa attività alta attività la fusicoccina promuove il legame delle proteine sul dominio C-terminale dell H + -ATPasi

90 l interazione tra H+-ATPasi e proteine è mediata dalla fosforilazione di un residuo di treonina nel dominio C-terminale della pompa protonica

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