Applicazioni di terapia mirata: Trastuzumab e terapia anticancro
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1 Università degli Studi dell'aquila Facoltà di Biotecnologie Applicazioni di terapia mirata: Trastuzumab e terapia anticancro di Mirko Occhiuzzi Relatore: Prof. Nicola Franceschini A. A
2 INTRODUZIONE Il presente lavoro di tesi approfondisce, sotto diversi aspetti, l approccio rivoluzionario che le terapie mirate hanno creato, già da qualche tempo, nel mondo scientifico e soprattutto in ambito clinico e diagnostico, dove ad oggi rivestono un ruolo di primaria importanza. L aggettivo mirata evidenzia una caratteristica specifica del farmaco che si serve di questo nuovo approccio terapeutico per la cura di particolari patologie: la sua spiccata selettività e specificità d azione su un target molecolare. Più precisamente, quando si parla comunemente di target therapy ci si riferisce ad una terapia che ha come target (bersaglio) uno specifico fattore alla base di una patologia, sia di natura infiammatoria che neoplastica. Si parla, quindi, di terapie che prendono di mira passaggi cruciali per lo sviluppo e la progressione di una patologia. In oncologia, in particolare, i nuovi farmaci vanno a colpire i meccanismi con cui le cellule normali si trasformano in cellule tumorali, crescono a dismisura e si diffondono ad altre parti del corpo. Colpire il target specifico è la peculiarità di tale approccio terapeutico, che fonda le proprie radici su un concetto teorico che, già agli inizi del novecento, aveva rivoluzionato la vecchia concezione scientifica delle patologie: il magic bullet di Paul Ehrlich. Il cambiamento apportato da tale concetto - rivoluzionario per l epoca - mostra nelle moderne terapie mirate tutta la sua valenza scientifica. Direzionare in maniera altamente selettiva e specifica un agente farmacologico su una cellula target, come se fosse un vero e proprio proiettile magico crea, indubbiamente, i presupposti per una migliore risoluzione della patologia, risparmiando, in tal modo, le cellule sane dall azione tossica. La conoscenza approfondita di specifici bersagli all interno di una cellula rappresenta uno degli elementi più critici per lo sviluppo di una terapia mirata, soprattutto in ambito oncologico, dove il gruppo dei tumori - caratterizzato da particolari target terapeutici - sembra essere, ancora oggi, molto ristretto. Proprio perché interferiscono in maniera specifica con i processi responsabili della nascita di un tumore, della sua crescita e della sua diffusione attraverso le metastasi, queste cure risparmiano in genere i tessuti sani. Le terapie mirate rappresentano, infatti, uno dei più importanti e potenti strumenti nella medicina definita personalizzata, 3
3 secondo cui per ogni malato occorre trovare una cura più appropriata che produca i migliori risultati con il minor carico possibile di effetti collaterali indesiderati. Dunque, considerata l importanza e la complessità dell argomento oggetto del presente lavoro, si è ritenuto opportuno focalizzare l attenzione - nella prima parte - sui principali processi produttivi e sulle differenze che caratterizzano la classe dei farmaci biotecnologici, diversamente definiti farmaci a bersaglio molecolare o biofarmaci. A tal proposito è stato senz altro utile fornire una ricostruzione storica delle principali scoperte biotecnologiche che hanno caratterizzato i secoli passati e che sono stati, come noto, precursori dei moderni farmaci biotecnologici. Infatti, la moderna concezione di farmaco biotecnologico si basa su un metodo di progettazione differente rispetto alle vecchie metodiche di sintesi organica, ma soprattutto, su una nuova teoria produttiva, che si avvale dei naturali e fisiologici eventi che accadono all interno di una cellula. L attenzione è stata rivolta, successivamente, ad una classe specifica di farmaci biotech che rappresenta una delle più importanti conquiste in ambito clinico e diagnostico per la cura di alcune neoplasie: gli anticorpi monoclonali. In riferimento a tali molecole sono state ampiamente illustrate sia le caratteristiche che le particolarità che il nostro sistema immunitario mostra nel produrle come risposta ad uno stimolo di natura antigenica. A tal proposito, sono state anche analizzate le principali tecniche estrattive ed identificative di cui si servono i moderni operatori del settore per la progettazione di classi anticorpali utilizzate al solo scopo terapeutico. A fronte delle principali differenze che emergono tra la classe degli anticorpi policlonali e quella degli anticorpi monoclonali, si arriva ad affermare, nel proseguo della trattazione, la preferenza di quest ultimi in ambito clinico e diagnostico. A fronte di tale ricostruzione introduttiva, il presente lavoro ha preso altresì in considerazione la moderna concezione terapeutica della cura del cancro mediante l utilizzo dei farmaci a bersaglio molecolare. Il loro utilizzo non viene limitato unitamente al solo anticorpo monoclonale ma, come è stato ampiamente argomentato nei paragrafi successivi al primo, può basarsi su una serie di approcci terapeutici risolutivi per la cura della neoplasia. Infatti, l anticorpo monoclonale può essere utilizzato come un vero e proprio carrier su cui viene trasportato il farmaco 4
4 citotossico (tossina, chemioterapico, isotopo radiattivo), creando, in tal modo, una nuova molecola terapeutica che và sotto il nome di immunoconiugato. L anticorpo monoclonale può, inoltre, essere coniugato ad un enzima e somministrato in concomitanza ad un profarmaco. Il principio generale d azione su cui si basa tale approccio terapeutico prende il nome di processo ADEPT (Antibody Directed Enzyme Prodrug), e riconosce, nell enzima coniugato all anticorpo monoclonale, il suo elemento distintivo. Infatti, tale enzima, veicolato dal legame selettivo dell anticorpo monoclonale nelle immediate vicinanze della cellula neoplastica, è in grado di convertire il profarmaco (variante inattiva del farmaco priva della valenza farmacologica) in farmaco attivo, quindi, capace di esplicare la sua azione citotossica sulle cellule neoplastiche. Il secondo capitolo ha ad oggetto lo studio di una patologia specifica che viene comunemente riconosciuta e trattata con un anticorpo monoclonale umanizzato (trastuzumab): il cancro mammario e, nello specifico, una variante più aggressiva e dalla prognosi più sfavorevole per il paziente, il cosiddetto tumore HER-2 positivo. Questo tipo di patologia esprime sulla membrana delle proprie cellule malate il recettore HER-2 appartenente alla famiglia dei recettori per il fattore di crescita dell epidermide, riconosciuto e successivamente legato da un anticorpo monoclonale, che già da qualche anno riveste un ruolo di primaria importanza in ambito medico: il trastuzumab. Questo anticorpo monoclonale umanizzato, ottenuto mediante transfezione del DNA codificante in cellule di roditore (cellule CHO), rappresenta l argomento centrale dei capitoli 3,4 e 5. Nel primo di questi tre capitoli viene considerato il suo approccio rivoluzionario nella terapia del tumore mammario HER2+; la sua straordinaria selettività di legame sulle cellule neoplastiche e la minima ripercussione su quelle sane. Il meccanismo d azione che esplica sulle cellule neoplastiche non è, ancora oggi, del tutto chiarito, ma si pensa possa nascere da un insieme di azioni ed effetti che l anticorpo monoclonale esercita sulle cellule neoplastiche. Il suo legame ai recettori HER-2, overespressi sulla membrana delle cellule cancerose, provoca una serie di eventi pro-apoptosi diretti ed indiretti, servendosi anche attivamente della risposta mediata dalle cellule del nostro sistema immunitario e delle proteine che fanno parte del complemento. L effetto finale è la morte delle cellule malate che 5
5 iperesprimono il recettore HER-2 e la totale salvaguardia delle cellule sane che vengono risparmiate totalmente dalla sua azione terapeutica. Il quarto capitolo è incentrato sulla comprensione del costrutto dell anticorpo monoclonale trastuzumab ma, soprattutto, sui vari meccanismi d azione che esplica a livello delle cellule malate. A fronte delle note proprietà del trastuzumab nei confronti delle cellule neoplastiche del tumore mammario HER-2+, nonché del suo legame selettivo e specifico su tali cellule, è stato creato recentemente un farmaco che rappresenta il capostipite degli anticorpi definiti armati, il T-Dm1, ottenuto dal legame tra il trastuzumab ed un potentissimo agente chemioterapico. In un paragrafo del quarto capitolo è stata trattata, dunque, la sua specificità d azione e l effetto terapeutico che esplica sulle cellule neoplastiche del tumore mammario HER-2+. Pertanto, alla luce della ricostruzione effettuata, è parso utile soffermarsi, nella parte conclusiva del lavoro, sugli elementi a favore e quelli contrari derivanti dall utilizzo della terapia con trastuzumab per la cura del tumore mammario HER2+. Sono stati, perciò, analizzati i suoi effetti collaterali e le principali differenze esistenti tra questo nuovo approccio terapeutico, ricco di evidenti risvolti pratici in ambito clinico e le comuni ed invalidanti risposte derivanti dalle vecchie terapie basate sui chemioterapici. 6
6 CAPITOLO I L EVOLUZIONE BIOTECNOLOGICA: STORIA E INNOVAZIONI Il termine biotecnologia è un neologismo la cui etimologia deriva dall unione di due sostantivi distinti: biologia, intesa come scienza che mira allo studio di tutto ciò che riguarda la vita, compresi i fenomeni e le leggi che la governano; tecnologia, intesa come studio primario delle scienze applicate e dei procedimenti per la trasformazione della materia prima in prodotti d' impiego o di consumo. Nell accezione moderna del termine, le biotecnologie s'identificano con le tecnologie che impiegano organismi viventi (microrganismi, piante, animali), le loro componenti cellulari e subcellulari o i loro prodotti (ormoni, tossine, enzimi), per l ottenimento di materiali utili all uomo. Le biotecnologie tradizionali, intese semplicemente come utilizzazione di organismi viventi (batteri, lieviti, cellule vegetali), risalgono a tempi preistorici. Pur senza la minima conoscenza teorica, per lungo tempo, gli uomini hanno ottenuto bioprodotti secondo metodi tradizionali, sperimentando tecniche di manipolazione degli alimenti prima ancora di tramandarne testimonianza scritta. Volendo tracciare un breve profilo storico dell impiego quotidiano delle metodiche basate su processi biotecnologici, potremmo addirittura partire dagli antichi Sumeri, con la fermentazione della birra, sino ad arrivare all origine reale ed effettiva delle biotecnologie avanzate, con la scoperta di batteri e lieviti, responsabili dei processi di trasformazione di sostanze alimentari. Tutto questo avvenne verso la metà del 1800, periodo in cui gli studi di Luigi Pasteur cominciano a far comprendere fenomeni usuali (fermentazione della birra, del vino e dell aceto) ma fino ad allora inesplicabili: questa è la ragione per cui Pasteur è considerato il padre della biotecnologia. Faranno seguito importanti e fondamentali scoperte, nei secoli successivi, che porteranno in rassegna processi e metodiche di fondamentale importanza per la moderna concezione biotecnologica. 7
7 Nell applicazione delle biotecnologie innovative, l industria farmaceutica ricopre un ruolo pioneristico e la cura della salute è il settore al quale le biotecnologie hanno finora dato l apporto e il contributo più efficace, sia in termini di prodotti (terapeutici, profilattici e diagnostici) che di ricerca e sviluppo. I primi anni 80 hanno visto comparire per la prima volta i prodotti della moderna biotecnologia farmaceutica dal momento in cui la Food and Drug Administration (FDA) ha approvato - nel l insulina prodotta da batteri ricombinanti mediante l inserimento nel loro DNA dell informazione genetica specifica. Si affianca, nel 1985, la produzione attraverso la tecnica del DNA ricombinante (rdna) dell ormone della crescita, cui seguiranno altri ormoni peptidici, citochine, enzimi, fattori della coagulazione, vaccini biotecnologici e anticorpi monoclonali (mab). La realizzazione biotecnologica di prodotti farmaceutici ha trasformato radicalmente l intero gruppo dei sistemi preventivi, diagnostici, curativi, ma anche produttivi. L industria farmaceutica biotecnologica è soprattutto un industria microbiologica, che utilizza la biologia molecolare come strumento per la messa a punto di bio-processi industriali che, partendo da microorganismi, permettono la produzione di farmaci di nuova concezione (farmaci biotecnologici). Difatti, la principale attività della bioindustria - definibile come comparto produttivo che abbraccia diversi settori che vanno dai prodotti farmaceutici e diagnostici sino all industria alimentare - è rivolta alla produzione di articoli farmaceutici e diagnostici. In questo settore in rapida crescita, le potenzialità offerte dalle biotecnologie sono rivoluzionarie. La terapia, infatti, può trarre vantaggio da farmaci molto più selettivi ed efficaci che, mimando meccanismi molecolari, naturali e fisiologici per la cellula, possono permettere il ripristino di condizioni compromesse, fornendo specificità d azione e riducendo gli effetti collaterali negativi [1]. L argomento di base della bioindustria che approfondiremo nel prossimo paragrafo riguarda, appunto, l ampio e variegato mondo del farmaco biotecnologico, anche conosciuto come biofarmaco. Prenderemo, dunque, in esame, sia la sua struttura fondamentale, i processi ed i sistemi relativi al loro impiego, che i vari aspetti peculiari che possono derivare dalla scelta di una terapia basata su farmaci biotech rispetto alla già nota terapia 8
8 basata su farmaci ottenuti con procedimenti estrattivi o per sintesi organica. Infine, focalizzeremo l attenzione su un gruppo specifico di farmaci biotecnologici, che oggi giorno ha quasi soppiantato completamente le prime proteine, ottenute mediante le tecniche del DNA ricombinante (rdna): gli anticorpi monoclonali. Una classe di farmaci che si riveleranno preziosi per numerose applicazioni, sia come tali che come carrier di farmaci su specifici siti bersaglio STRUTTURA E FUNZIONI DEL FARMACO BIOTECNOLOGICO La maggior parte delle ricerche in campo biotecnologico è oggi diretta alla diagnosi, terapia e prevenzione delle patologie dell uomo. Dagli anni 70, grazie all introduzione di metodologie innovative, quali la tecnologia del DNA ricombinante, la PCR e la tecnologia degli ibridomi, le biotecnologie farmaceutiche hanno avuto un enorme spinta che ha permesso la produzione - su larga scala - di proteine tipiche dell organismo umano, ottenibili per altre vie in quantità molto limitata. Il processo di ricerca e sviluppo di nuovi farmaci, con l avvento delle moderne tecniche molecolari e biotecnologiche, sta nettamente cambiando: l approccio odierno è, infatti, più che altro di tipo biologico (cellulare e molecolare), a differenza di anni fa in cui era, in prevalenza, di tipo chimico ed estrattivo [2]. I farmaci biotecnologici, diversamente anche detti biofarmaci o farmaci a bersaglio molecolare, possono essere definiti come il prodotto di organismi geneticamente modificati. Ne sono esempi le prime proteine ricombinanti (ottenute mediante la tecnica del rdna), gli ormoni polipeptidici, i derivati del sangue (agenti sia trombolitici che coagulanti), le citochine (interleuchine, interferoni, fattori di crescita) e i vaccini ricombinanti che, diversamente dai vaccini tradizionali, impiegano solo l antigene e non il patogeno intero. A differenza dei farmaci tradizionali, costituiti da piccole molecole (small molecules), i farmaci biotech sono costituiti da macromolecole di natura proteica o derivati degli acidi nucleici. Sono, quindi, prodotti che, a differenza dei primi, mostrano un peso molecolare (PM) 9
9 molto più alto [3]. Tra le due classi di farmaci sussistono dunque differenze rilevanti nelle fasi di ricerca, sviluppo e produzione. Tali differenze costituiscono dei fattori critici, che devono essere valutati attentamente nello sviluppo e nell utilizzo clinico di un farmaco biotecnologico. I principali fattori critici sono sintetizzati di seguito [4]: Contrariamente ai farmaci convenzionali, le proteine terapeutiche (farmaci biotech.) non possono essere prodotte per sintesi, ma soltanto per fermentazione o mediante colture di cellule di mammifero. I biofarmaci sono progettati generalmente a partire da un meccanismo d azione (o da un target biologico) noto, o almeno atteso. Rispetto ai farmaci tradizionali, che possono avere più siti d azione e più vie di escrezione, le proteine sono dotate di una maggiore specificità e garantiscono una maggiore purezza e sicurezza d impiego. La presenza di sostanze contaminanti (ad esempio composti azotati di origine batterica) legate al processo di produzione, può provocare reazioni avverse di incompatibilità. La degradazione del farmaco, lungo il tratto gastrointestinale, impone la somministrazione per via parenterale (non per tutti i prodotti biotech) e, in taluni casi, il rilascio al sito target può risultare critico, a causa della degradazione da parte di enzimi metabolici. Per aumentare l emivita plasmatica della proteina ricombinante possono essere richieste dosi elevate e somministrazioni frequenti, con la conseguente insorgenza di effetti indesiderati a carico di differenti organi o compartimenti corporei (per esempio la frequente reazione di ipersensibilità). Mentre per i farmaci tradizionali la data di scadenza viene stabilita mediante test accelerati di stabilità, condotti a temperature e gradi di umidità superiori a quelle di stoccaggio, per le proteine ciò non è attuabile, data la loro palese termolabilità. La data di scadenza si deve, quindi, stabilire mediante studi di stabilità condotti in condizioni reali. 10
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