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1 IL MATERIALE CONTENUTO IN QUESTE DIAPOSITIVE E AD ESCLUSIVO USO DIDATTICO PER L UNIVERSITA DI TERAMO LE IMMAGINE CONTENUTE SONO SCARICATE DAI SITI WEB DI CUI SONO RIPORTATI I LINK

2 METODOLOGIE BIOCHIMICHE aa 2016/2017 LABORATORIO DI Spettroscopia UV-vis Spettrofluorimetria Annalaura Sabatucci

3 SPETTROSCOPIA L interazione tra LUCE e materia1. DIFFUSIONE-DIFFRAZIONE da luogo a fenomeni di : 2. ASSORBIMENTO Generazione di spettri La spettroscopia è lo studio di tali interazioni. Per campioni di tipo biologico, in funzione dell energia della radiazione e del tipo di interazione, si possono ottenere spettri di diverso tipo che forniscono diverse informazioni di carattere fisico e/o chimico sul campione da analizzare. Informazioni sulla struttura della materia

4 LA LUCE e un onda E.M. L energia associata ad un onda E.M. e QUANTIZZATA (cioè suddivisa in unità discrete) E=hn h=costante di Planck ( J s) n=frequenza Max Planck ES. Un fascio di luce con lunghezza d onda di 300 nm ha associata un energia di : E=hn=h(c/l)= *3*10 8 / = J= 4.1 ev (1eV= J = energia cinetica di un elettrone accelerato da una ddp di 1 V) E=hn=hc/l

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6 UV-VISIBILE Lunghezza d'onda (l) nm nm (UV vicino e visibile) (UV) Frequenza (n) 1.5 THz-375 GHz 300THz-1.5THz E (ev) INTERAZIONE Elettroni di valenza ionizzazione TECNICA di assorbimento TECNICA di diffusione Colorimetria Fluorimetria light scattering spettrofotometria UV

7 SPETTROFOTOMETRIA UV-vis Schema di uno spettrofotometro Lampada al deuterio (UV) + Lampada tungsteno (vis) Trasmittanza: T=I/I 0 Legge di Lambert-Beer: T=10 -ecl => logt=-ecl= - logt =log (1/T) =A (Assorbanza) = ecl e= coefficiente di estinzione (coefficiente di assorbimento caratteristico del campione ad una particolare lunghezza d onda in una serie definita di condizioni e molare (M -1 cm -1 ) e 0.1% assorbanza allo 0.1% di proteina in soluzione (mg/ml) c= concentrazione della proteina l= cammino ottico (di solito 1 cm)

8 Aspetti pratici Risoluzione dello strumento: Limite inferiore: A=0.02 (sotto: rumore di fondo) Limite superiore: A=circa 2 (sopra: saturazione dello strumento) => diluire il campione se molto concentrato Portacampioni: cuvetta di quarzo *(assorbimento quasi nullo) con cammino ottico generalmente 1 cm => A=ec Sottrazione del fondo dal segnale del campione di interesse mediante misura del BIANCO (ossia del tampone nel quale viene preparato il campione) * Valore commerciale 130 euro

9 CAMPIONI BIOLOGICI: A) Regione UV : determinazione della concentrazione di proteine e acidi nucleici assorbimento delle proteine dovuto alle catene laterali degli aa aromatici (regione nm) (Triptofano, tirosina, fenilananina) Assorbimento del DNA (intorno a 260 nm) dovuto alle basi azotate

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11 Fluorescent Characteristics of the Aromatic Amino Acids Absorption Fluorescence Amino Acid Wavelength (nm) Absorbtivity Wavelength (nm) Quantum Yield Tryptophan Tyrosine Phenylalanine Peptide and Amino Acid Quantification Using UV Fluorescence in Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader Paul Held Ph. D., Senior Scientist, Applications Dept., BioTek Instruments, Inc.

12 B) Regione visibile: STUDIO DI METALLOPROTEINE: Alcune proteine contengono gruppi cromofori (Es. l eme nell emoglobina) o metalli legati (es. Cu nell Hc). L assorbimento nella regione visibile in questo caso può essere sfruttato per analizzare cambiamenti nella molecola all intorno al cromoforo. Nel caso di Hc e Hb il grado di ossigenazione C. Aestuarii Hc CINETICA ENZIMATICA: nel caso in cui substrato o prodotto di una reazione enzimatica assorbano luce in una regione dello spettro in cui non assorbano altri substrati o prodotti, la cinetica di reazione può essere seguita tramite spettrofotometria COLORIMETRIA: Composti biochimici privi di colore possono essere convertiti in composti colorati da reazioni cromogene (Metodi colorimetrici per la determinazione della concentrazione delle proteine - biureto, Lowry, Bradford )