Applicazioni precliniche delle cellule staminali: uso delle cellule da liquido amniotico in un modello murino di stroke

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1 Applicazioni precliniche delle cellule staminali: uso delle cellule da liquido amniotico in un modello murino di stroke

2 Cerebral Stroke Terza causa di morte dopo le malattie cardiovascolari e le neoplasie, causando il 10-12% di tutti i decessi per anno, e rappresenta la principale causa d invalidità (Borlongan et al.2007)

3 Frequenza L ictus ischemico rappresenta la forma più frequente di stroke (80-85%) L ictus emorragico rappresenta il 15-20%

4 Stroke: Fattori di rischio non modificabili Età (in crescita esponenziale) Sesso (M:F = 3:2) Etnia Fattori genetici

5 Stroke: Fattori di rischio modificabili Stile di vita Fumo di sigaretta (RR 2-4) 2 Alcool alte dosi (RR 1-4) 1 Inattività fisica Obesità Droghe (cocaina) Uso di contraccettivi orali

6 Trapianto delle cellule staminali:una nuova terapia per lo stroke (Tang et al 2007) : Sostituzione delle cellule non funzionali Induzione della proliferazione e del differenziamento delle cellule staminali endogene

7 Neurogenesi e cellule staminali mesenchimali (Borlongan et al.2007) Il processo di neurogenesi è legato ai fattori neurotrofici secreti dalle cellulle MSCs. MSCs producono: Hepatocyte growth factor (HFG) Vascular endothelial growth factor (VEGF) Nerve growth factor (NGF) Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Basic fibroblast growth factor (bfgf,fgf-2)

8 Successo del trapianto Sopravvivenza Acquisizione di un fenotipo specifico Integrazione funzionale

9 Una promettente risorsa:il liquido amniotico (LA) Caratteritiche delle AFS: Pluripotenza Stabilità mitotica Non tumorigenicità

10 Genetica Molecolare Chieti: esperienza nella coltura e differenziazione di cellule staminali da liquido amniotico MCG Augusta: esperienza nel trapianto di staminali da midollo osseo in modelli animali di stroke

11 Obiettivi della collaborazione Dimostrare la staminalità delle cellule isolate dal liquido amniotico di ratto Valutare l'efficacia del trapianto delle cellule staminali isolate dal liquido amniotico di ratto

12 Esperimenti di trapianto delle cellule staminali di LA di ratto a) Induzione dello stroke b) Isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal liquido amniotico da ratte gravide c) Trapianto intracerebrale o intravenoso delle cellule staminali d) Test cognitivo-comportamentali sui ratti trapiantati e) Studi di immunoistochimica

13 Protocollo di induzione dello stroke Il ratto è anastetizzato con 6cc/kg di Pentobarbitol Taglio a V lungo lo sterno facendo attenzione a non incidere le vene giugulari e la tiroide La carotide comune deve essere completamente separata dal nervo vago

14 Protocollo di induzione dello stroke Legatura della carotide comune Legatura della carotide esterna Piccola incisione nelle carotide interna Ostruzione della carotide interna mediante un filamento di mm Rimozione del filamento e delle legature dopo 1h

15 Sintomi dello stroke nel ratto Colore bianco brillante degli occhi Problemi nella deambulazione a causa dell'emiparesi

16 Post-Stroke (Borlongan et al 2007) L'occlusione delle carotidi può condurre allo sviluppo di un centro ischemico e un centro di penombra Centro ischemico: il flusso sanguigno è ridotto almeno del 85% Centro di penombra: il flusso sanguigno è ridotto del 40-60%

17 Isolamento delle cellule staminali da LA di ratto Ratte gravide al 14 giorno di gestazione Prelievo della placenta mediante intervento chirurgico Amniocentesi

18 Protocollo di coltura Medium: IMDM (Iscove modified Dulbecco medium) Siero: FCS 20% Antibiotici: penicillina (100u/ml) streptomicina (100µg/ml) Citochine: 5ng/ml bfgf (basic fibroblast growth factor)

19 Crescita cellulare Comparsa delle prime colonie dopo 5 giorni dal prelievo. Cellule altamente proliferanti Coltura delle cellule per25gg

20 Trapianto intravenoso Dopo 48h dall'induzione dello stroke, i ratti sono anestetizzati con il Pentobarbitol. Trapianto a livello della vena giugulare: liquido amniotico fresco cellule staminali coltivate

21 Test cognitivo-comportamentali comportamentali sui ratti trapiantati 2 giorni dopo il trapianto Valutazione della funzione motoria Valutazione della funzione neurologica

22 Risultati dei test cognitivo-comportamentali comportamentali Cellule staminali mesenchimali isolate dal liquido amniotico di ratto sono in grado di promuovere il recupero dei deficits motori causati dallo stroke miglioramento della funzione motoria >50%

23 Risultati dei test cognitivi comportamentali Cellule staminali mesenchimali isolate dal liquido amniotico di ratto sono in grado di promuovere il recupero dei deficits neurologici causati dallo stroke miglioramento della funzione neurologica >30%

24 Studi di immunoistochimica in vitro Le cellule dopo 25 gg di coltura sono fissate in paraformaldeide al 4%. Analisi della espressione di marcatori tipici delle staminali embrionali (Oct-4, SSEA)

25 Studi di immunoistochimica in vivo I ratti sono sacrificati e perfusi attraverso l'aorta con 100 ml di soluzione fisiologica seguita da 300 ml di paraformaldeide al 4% Il cervello è rapidamente rimosso, congelato e tagliato al criostato. Le indagini immunoistochimiche in vivo valutano la sopravvivenza delle cellule trapiantate e l'espressione di marcatori neuronali.

26 Risultati dell'immunoistochimica in vitro in vitro Cellule staminali isolate dal liquido amniotico di ratto dopo 25 gg di coltura >99% Oct4+

27 Risultati dell'immunoistochimica in vitro in vitro Cellule staminali isolate dal liquido amniotico di ratto dopo 25 gg di coltura >99% SSEA+

28 Conclusioni Il liquido amniotico (LA) di ratto rappresenta una buona fonte di cellule staminali Cellule staminali isolate dal liquido amniotico di ratto sono in grado di promuovere il recupero dei deficits neurologici e motori causati dallo stroke Le cellule coltivate del LA sono terapeuticamente più efficienti delle cellule del LA fresco

29 Prossimi passi Studi di immunoistochimica in vivo: selezione di marker capaci di identificare le cellule del liquido amniotico all'interno del tessuto cerebrale Monitoraggio a lungo termine (50-60gg) degli effetti del trapianto delle cellule staminali nei ratti con stroke. Identificazione di geni differenzialmente espressi in cellule staminali fresche e coltivate: Studio dei profili di espressione genica mediante tecnica dei microarray

30 Laboratorio di Genetica Molecolare, Università G. d Annunzio U.O. di Genomica Funzionale, CESI Ivana Antonucci Rino Stuppia Giandomenico Palka Department of Neurology, Medical College of Georgia, Augusta Cesar Borlongan Mohammed Ali Mina Maki Tadashi Masuda David Hess