Traduzione integrale ( non ufficiale) del metodo L35 LMBG Gennaio 1995 L (include l errata corrige del dicembre 2002)
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- Giustina Poli
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1 Traduzione integrale ( non ufficiale) del metodo L35 LMBG Gennaio 1995 L (include l errata corrige del dicembre 2002) Ricerche su Alimenti ( L35LMBG ) Determinazione di Ammine Aromatiche Primarie in simulanti alimentari acquosi 1. Scopo e campo di applicazione Questo metodo analitico consiste nella determinazione fotometrica di Ammine Aromatiche Primarie in simulanti alimentari acquosi ( acqua distillata, acido acetico 3%, etanolo 10 % e 15%) 2. Principio Le Ammine Aromatiche Primarie ( es. 2,4- Toluilendiammina, 4, 4 diamminodifenil metano) poiché presenti in articoli possono migrare nel contatto con alimenti. Per contenuto di Ammine Aromatiche Primarie nei simulanti alimentari ( paragrafo 1) si intende il contenuto di Anilina idrocloruro, come sostanza di riferimento, determinato secondo il metodo qui descritto. Tale quantità si esprime in µg/100 ml. 3. Sintesi Le Ammine aromatiche eventualmente presenti nella soluzione del campione si diazotano in una soluzione di Acido Cloridrico e successivamente si copulano con N-(1- Naftil)etilendiammina diidrocloruro (CAS ; SIGMA G), per cui si forma una soluzione di colore violetto. La concentrazione del composto colorato si effettua su colonna di estrazione in fase solida. Il contenuto di Ammine aromatiche primarie, calcolate come Anilina idrocloruro, viene determinato fotometricamente alla lunghezza d onda di 550 nm. 4. Prodotti chimici Se non indicato diversamente,: - sostanze chimiche di grado analitico - per soluzione si intende una soluzione acquosa L acqua deve essere distillata o di corrispondente purezza 4.1 simulanti alimentari Acqua distillata 1
2 Acido acetico ( ρ =30g/l,) 1 Etanolo σ =10% e σ =15 % (n dt: stessa nota n.1) 4.2 Soluzione stock di Anilina idrocloruro (ρ= 50 mg/l) 10,0 mg di Anilina idrocloruro vengono pesati, sciolti in una piccola quantità del simulante ( 4.1) e trasferiti quantitativamente in matraccio tarato da 200 ml. Aggiungere il simulante prescelto fino al segno. 4.3 Soluzione stock diluita di Anilina idrocloruro ( ρ= 0.5mg/l) 5.0mL di Soluzione stock di Anilina Idrocloruro (4.2) vengono trasferiti con pipetta in un matraccio tarato da 500mL, aggiungendo il simulante prescelto fino al segno 4.4 Acido Cloridrico c= 1 mole/l ( 1N), c= 0,5 moli/l (0,5 N), c= 0,1 moli/l (0,1N)( NdT vedi nota 1) 4.5 Soluzione di eluizione: Miscelare 80 parti in volume di metanolo con 20 parti in volume di acido cloridrico 0,5 N 4.6 Soluzione di Nitrito di Sodio ρ= 0,5 g/100ml 4.7Soluzione di Solfammato di Ammonio ρ = 2,5g/100 ml 4.8 Reagente copulante: 1 g di di N-(1-naftil)-etilendiammina didrocloruro viene disciolto in acqua ; la soluzione viene trasferita in una matraccio tarato da 100 ml e portata a volume con acqua. Ripreparare fresca ogni giorno. 5. Apparecchiature 5.1 Spettrofotometro con filtro a 550 nm 1 ρ= concentrazione in massa σ = concentrazione in volume c = concentrazione molare 2
3 5.2 Cuvette in vetro lunghezza 2 o 4 cm 5.3 Colonne per estrazione in fase solida (ODS, 1000 mg, p.es. Bond Elut) 5.4 Unità per vuoto 6. Campionamento 6.1 Campionamento-Piano di prova (Non ancora disponibile nel campo di applicazione ufficiale) 7. Procedimento 7.1 Trattamento del campione La migrazione è verificata con il simulante in condizioni di prova appropriate. Subito dopo 100 ml di soluzione di migrazione vengono introdotti in un becher da 150 ml (soluzione del campione) 7.2 Derivatizzazione Aggiungere alla soluzione del campione 12,5 ml di soluzione di Acido Cloridrico 1N e 2,5 ml di soluzione di Nitrito di Sodio. Dopo 10 minuti aggiungere 5 ml di soluzione di Solfammato d Ammonio e dopo altri 10 minuti aggiungere 5 ml del Reagente di copulazione. Miscelare dopo ogni aggiunta di reagenti. 120 minuti dopo l'aggiunta del reagente di copulazione, effettuare la concentrazione del colorante su colonna di estrazione in fase solida con uso di vuoto 7.3 Concentrazione Condizionare la colonna per estrazione in fase solida con 12 ml di metanolo, 12 ml di soluzione di eluizione e con 12 ml di acido cloridrico 0,1N. Con l'aiuto di un reservoir, le soluzioni del campione derivatizzate sono introdotte nella colonna, e il becher viene lavato due volte con 3 ml di acido cloridrico 0,1 N. Successivamente, lavare il reservoir e la colonna due volte con 3 ml di acido cloridrico 0,1 N e lasciare andare a secco la colonna (1 minuto). Infine, eluire il composto colorato con 4-5 ml di soluzione di eluizione dalla colonna a un matraccio tarato da 5 o 10 ml. Dopo aggiunta di soluzione di eluizione, trasferire in una cuvetta da 2 cm o da 4 cm e misurare l estinzione della soluzione a 550 nm in parallelo con una soluzione di bianco matrice. 7.4 Soluzione di bianco 3
4 Poiché la soluzione di migrazione può essere colorata deve essere predisposto per ogni campione un bianco. A tal fine, 100 ml di soluzione del campione sono addizionati con tutti i reagenti di derivatizzazione (7.2) ad eccezione della soluzione di Nitrito di Sodio e quindi concentrati secondo paragrafo Preparazione della curva di taratura Per ogni mezzo di prova viene preparata una curva di taratura. A tal fine vengono pipettati ogni volta 1, 2, 3, 4, 6, 8 e 12 ml della soluzione standard di Anilina idrocloruro (4.3) in un becher di vetro e portati a peso di 100g con il rispettivo simulante. Le concentrazioni delle soluzioni sono di conseguenza comprese tra 0,5 e 6 µg/100 ml. La derivatizzazione e la concentrazione vengono eseguite secondo i paragrafi 7.2 e 7.3. Un bianco con 100 ml di mezzo di prova viene lavorato in parallelo con ogni curva di taratura 8. Valutazione 8.1 Calcolo I valori misurati dalle curve di taratura e le concentrazioni delle soluzioni sono sottoposti a calcolo di regressione. Con i fattori a e b determinati in tal modo, il contenuto di Ammine Aromatiche Primarie, espresso come Anilina Idrocloruro in µg/100 ml viene calcolato secondo la seguente equazione: ρ = a + b. valore misurato 8.2 Affidabilità ( prestazioni) e limiti di rivelabilità del metodo Ripetibilità (r) e Riproducibilità (R) (espressa in µg Anilina idrocloruro/100 ml) Acqua Acido acetico 3% Etanolo 10% Etanolo 15% r 0,087 0,097 0,130 0,205 R 0,239 0,196 0,287 0, Limiti di rivelabilità (LR) 4
5 LR = 0,2 μg Anilina idrocloruro /100 ml nei simulanti indicati al paragrafo Rapporto di Prova Nel rapporto di Prova includere il riferimento al metodo ufficiale indicando almeno: Tipo, origine e denominazione della prova Tipo e data del campionamento Data di ricezione e data della prova Risultato della prova Motivazioni in caso di deviazioni da questo metodo ufficiale 10. Osservazioni e riferimenti 10.1 Si rimanda alla parte introduttiva della Raccolta ufficiale per le spiegazione generali, si veda il Manuale per la stesura di un metodo Questo metodo ufficiale richiesto dalla Commissione Kunststoffe ( Plastiche) del Dipartimento Federale della Salute Pubblica Comitato di Analisi della Commissione Metodi ( L ( Novembre 1982) con lo scopo di abbassare il limite di rivelabilità revisionato. Il metodo è stato verificato in un ring test su 6 soluzioni di Anilina idrocloruro (0,25 0,50 0,75 1,00 1,5 2,0 μg/100 ml) Dal risultato del sopramenzionato ring test sono state determinate la ripetibilità (f) e la Riproducibilità ( R) secondo ISO /DIN Il limite di rivelabilità è stato determinato sulla base della curva di taratura. Il calcolo della Riproducibilità è stato effettuato sulla base di certezza statistica del 95% 10.4 Secondo questo metodo ufficiale vengono determinate le ammine aromatiche primarie migrate da articoli per contatto con i simulanti alimentari acqua distillata, acido acetico 3% (ω=3%) e etanolo (σ=10%). Il metodo è applicabile a tutti gli articoli per i quali è possibile ritenere che vi sia una cessione di ammine aromatiche primarie negli alimenti. 11. Bibliografia Bratton A.c., Marshall, E.K. Babitt Ir D und Hendrickson, A. R. : J Biol. Chem. 128, 537 ( 1939) Brauer B., Funke, T., Deutsche Lebensm. Rndsch. 87, 280 (1991) 5
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