CARATTERIZZAZIONE DEI GLICOSAMINOGLICANI URINARI: APPLICAZIONE DI NUOVE METODICHE ALLA DIAGNOSI E AL FOLLOW-UP DELLE MUCOPOLISACCARIDOSI

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1 UNIVERSITA POLITECNICA DELLE MARCHE Facoltà di Medicina e Chirurgia DOTTORATO DI RICERCA in Patologie Immunometaboliche, Degenerative, e Infettive X Ciclo Coordinatore: Chiar. mo Prof. P.E.Varaldo CARATTERIZZAZIONE DEI GLICOSAMINOGLICANI URINARI: APPLICAZIONE DI NUOVE METODICHE ALLA DIAGNOSI E AL FOLLOW-UP DELLE MUCOPOLISACCARIDOSI Relatore: Chiar. mo Prof. Orazio Gabrielli Dottoranda: Dr.ssa Lucia Santoro ANNO ACCADEMICO

2 Alle mie adorate figlie

3 INDICE 1. INTRODUZIONE LE MUCOPOLISACCARIDOSI a. Mucopolisaccaridosi tipo I b. Mucopolisaccaridosi tipo II c. Mucopolisaccaridosi tipo III d. Mucopolisaccaridosi tipo IV e. Mucopolisaccaridosi tipo VI f. Mucopolisaccaridosi tipovii g. Mucopolisaccaridosi tipo IX Diagnosi Terapie attuali Terapie future I GLICOSAMINOGLICANI Catabolismo dei glicosaminoglicani Analisi dei glicosaminoglicani SCOPO DELLO STUDIO MATERIALI Pazienti METODI Metodo al DMB Elettroforesi su acetato di cellulosa Dosaggio delle esosamine Metodo dei disaccaridi RISULTATI DMB Elettroforesi su acetato di cellulosa Dosaggio delle esosamine mediante CE & HPLC Metodo dei disaccaridi DISCUSSIONE CONCLUSIONI BIBLIOGRAFIA...79

4 1.INTRODUZIONE Le Malattie Rare vengono spesso diagnosticate in ritardo quando oramai si sono verificati danni irreversibili agli organi, rendendo le terapie, laddove disponibili, assai meno efficaci. D altro canto tali patologie sono caratterizzate sovente da andamento progressivo ed ingravescente e possono quindi essere controllate o arrestate tanto meglio quanto più precocemente diagnosticate, anche in assenza di un evidente sintomatologia. E questo il caso delle Mucopolisaccaridosi: malattie rare dovute all accumulo lisosomiale di glicosaminoglicani e causate da uno specifico deficit enzimatico che ne compromette la corretta degradazione. Dal punto di vista clinico una diagnosi precoce ed accurata di mucopolisaccaridosi (MPS) è quindi necessaria per ottimizzare l esito del trattamento, prevenendo così danni cellulari irreversibili, in particolare nelle forme soggette a trattamento con nuovi ed efficaci approcci terapeutici quali la terapia enzimatica sostitutiva (ERT). Inoltre, una valutazione accurata del follow-up di trattamento con l impiego di markers affidabili potrebbe aumentare l efficacia di trattamento, attraverso una migliore definizione di dosaggi e tempi, dando origine ad una terapia personalizzata. Ne consegue che è fondamentale creare quanto prima i presupposti per un piano di screening neonatale esteso a tutta la popolazione dei nuovi nati. Questa necessità è ancora più impellente se si considera che le moderne terapie di sostituzione enzimatica sono efficaci se attuate sin dalle prime settimane di vita del neonato. L obiettivo di questo lavoro è quello di proporre dei nuovi metodi semplici, affidabili, non invasivi, riproducibili ed economici per la diagnosi ed il follow-up delle diverse forme di MPS. Dal punto di vista sperimentale è stato ideato un protocollo di determinazione qualitativa e quantitativa dalle esosamine contenute nelle urine mediante due 1

5 differenti metodologie: Elettroforesi Capillare in UV e HPLC in fluorescenza. I risultati ottenuti con entrambi i metodi confermano l esistenza di una correlazione tra concentrazione di esosoamine urinarie e contenuto in glicosaminoglicani. Inoltre è stata impiegata una procedura d analisi già nota, la misurazione dei disaccaridi con HPLC in UV, ma mai applicata sinora allo studio dei glicosaminoglicani umani. Tale procedura analitica viene applicata, al monitoraggio della terapia al fine di ottimizzarne l efficacia. Sono stati analizzati campioni di soggetti controllo e di pazienti affetti da vari tipi e forme di mucopolisaccaridosi, seguiti presso la Clinica Pediatrica dell Università di Ancona. Lo studio è stato condotto in parte presso il Laboratorio di Diagnosi e Prevenzione delle Malattie Metaboliche di Ancona ed in parte presso il Laboratorio di Biochimica del Dipartimento di Biologia dell Università di Modena e Reggio Emilia. Trattasi di un progetto collaborativo di ricerca dal carattere di forte innovatività scientifica e dagli utilissimi risvolti sulla pratica clinica. 2

6 1.1. LE MUCOPOLISACCARIDOSI Le Mucopolisaccaridosi (MPS) rappresentano un gruppo di patologie rare (Ic 1: nati vivi [1] da accumulo lisosomiale causate dal deficit di enzimi che catalizzano la degradazione dei glicosaminoglicani (mucopolisaccaridi). A seconda del tipo di deficit enzimatico può essere bloccata o ostacolata la degradazione del dermatansolfato, dell'eparansolfato, del cheratansolfato, del condroitinsolfato e dell'acido ialuronico, singolarmente o in combinazione. Sono noti 11 enzimi carenti che danno origine a sette forme distinte di Mucopolisaccaridosi come indicato nella tabella che segue. Mucopolisaccaridosi Eponimo MPS -osi I H α-l-iduronidasi Hurler Difetto MPS -osi I S α-l-iduronidasi Scheie MPS -osi I H/S α-l-iduronidasi Hurler/Scheie MPS -osi II Iduronato sulfatasi Hunter MPS -osi III A Eparan-N-sulfatasi Sanfilippo A MPS -osi III B α-n-acetil-glucosaminidasi Sanfilippo B MPS -osi III C MPS -osi III D MPS -osi IV A Acetil-CoA:α -glucosaminide acetiltransferasi N-Acetilglucosamina-6- solfatasi N-Acetilgalattosamina-6- solfatasi Sanfilippo C Sanfilippo D Morquio A 3

7 MPS -osi IV B β-galattosidasi Morquio B MPS -osi VI N-Acetilgalattosamina - 4 solfatasi (Arilsolfatasi B) Maroteaux- Lamy MPS -osi VII β-glucuronidasi Sly MPS -osi IX Ialuronidasi Le mucopolisaccaridosi, come la stragrande maggioranza delle malattie lisosomiali, sono malattie genetiche ereditarie che si trasmettono con modalità autosomica recessiva (Fig. 1), fatta eccezione per la malattia di Hunter o MPS II che è X-linked. Fig.1. Schema di trasmissione autosomica recessiva Le manifestazioni cliniche che caratterizzano le diverse MPS sono essenzialmente correlate alla quantità e al tipo di sostanza accumulata, da cui in genere prende origine la denominazione delle malattie. La conseguenza di tale deficit è un accumulo intracellulare di glicosaminoglicani cui consegue una disfunzione cellulare, tissutale, d organo ed un anomala escrezione urinaria degli stessi. Dal momento che i lisosomi sono contenuti in tutte le cellule dell organismo, fatta eccezione per i globuli 4

8 rossi, il difetto metabolico si verifica contemporaneamente a carico di vari organi e apparati. I neonati MPS sono asintomatici, sebbene l accumulo inizi nel periodo fetale formando le basi patologiche [2]. Come tutte le malattie d accumulo anche le mucopolisaccaridosi sono progressive, ad esordio variabile nei primi anni di vita ed accomunate da alcune caratteristiche cliniche quali tratti grossolani del volto, macrocrania, ipostaturalità, anomalie scheletriche, epatosplenomegalia, ritardo mentale, opacità corneale e sordità, reperti clinici non presenti in tutte le forme. Un grave ritardo mentale è presente nella Mucopolisaccaridosi IH (Sindrome di Hurler), nella forma grave di Mucopolisaccaridosi II (Sindrome di Hunter), e in tutti i sottotipi di Mucopolisaccaridosi III (Sindrome di Sanfilippo), mentre negli altri tipi l'intelligenza può rimanere normale. Le lesioni ossee della Mucopolisaccaridosi IV (Sindrome di Morquio) sono specifiche di questo disordine. lisosoma nucleo Cellula normale lisosoma Cellula con accumulo Fig.2. A sn schema di cellula con accumulo. A dx interessamento multiorgano nelle mucopolisaccaridosi 5

9 MUCOPOLISACCARIDOSI TIPO I (S. di HURLER, S. di SCHEIE, S. di HURLER/SCHEIE) La Mucopolisaccaridosi tipo I è dovuta al difetto dell enzima α-l-iduronidasi. Ne esistono tre varianti che si distinguono a seconda della gravità: la sindrome di Hurler che è la forma più grave, la sindrome di Scheie la più lieve e la sindrome di Hurler-Scheie che presenta un fenotipo intermedio. La S. di Hurler/Scheie e la S. di Scheie sono anche dette forme attenuate. Il deficit di α-l-iduronidasi può determinare tre quadri clinici differenti, ma che sono un continuum di segni e sintomi di gravità variabile in base alle mutazioni del gene responsabile della malattia. La S. di Hurler e la S. di Scheie rappresentano le due estremità, rispettivamente la forma più grave e quella meno grave dello spettro clinico, mentre la S. di Hurler/Scheie presenta un fenotipo intermedio. La Mucopolisaccaridosi I/H (S. di Hurler), si manifesta già a partire dal primo anno di vita con manifestazioni cliniche caratteristiche, quali una facies lievemente grossolana, la presenza di un ernia inguinale e/o ombelicale e di una modesta epato- 6

10 splenomegalia. Verso la fine del primo anno i lineamenti del volto diventano sempre più marcati, incomincia a manifestarsi un ritardo neuromotorio, l epatosplenomegalia è più marcata, la cute ispessita ed iniziano a comparire le limitazioni alle grandi articolazioni. Il quadro clinico si completa tra il 2 e il 3 anno di vita, periodo in cui la facies assume il caratteristico aspetto a mascherone di fontana con macrocrania, sopracciglia marcate, ipertricosi, radice del naso infossata, narici larghe e anteverse con corizza mucopurulenta costante, labbra ispessite, macroglossia. Frequentemente è possibile osservare anche turbe del circolo liquorale con conseguente idrocefalo. A carico dell occhio è presente un opacità corneale evidenziabile con l esame della lampada a fessura nelle fasi iniziali e alla semplice ispezione nelle fasi più avanzate della malattia; anche la funzione uditiva si riduce con il tempo. Il torace si deforma per la comparsa di una cifosi dorso-lombare progressivamente ingravescente e l addome è voluminoso per la marcata epato-splenomegalia e per l ipotonia della parete addominale. Con il tempo compaiono generalmente soffi cardiaci per l accumulo di glicosaminoglicani sui lembi valvolari. La motilità articolare si riduce progressivamente, determinando atteggiamenti in semiflessione degli arti, mentre le mani assumono il caratteristico aspetto ad artiglio. La crescita staturale si riduce notevolmente e l insieme delle anomalie scheletriche configura il quadro denominato disostosi multipla. Il ritardo mentale è molto grave. L exitus si verifica entro la prima decade di vita. La Mucopolisaccaridosi I/S (S. di Scheie) è un affezione molto rara, ad esordio tardivo; infatti raramente viene diagnosticata in età pediatrica. I segni clinici sono rappresentati da modeste limitazioni articolari, specie alle mani con associata la sindrome del tunnel carpale, lieve epatomegalia ed opacità corneale; il quadro clinico si completa generalmente in epoca adolescenziale; non è presente ritardo mentale né deficit staturale; i lineamenti del volto possono essere solo lievemente dismorfici, mentre frequente è l interessamento valvolare cardiaco, specie aortico. La prognosi è buona, la maggior parte dei pazienti raggiunge l età adulta avanzata. 7

11 La Mucopolisaccaridosi IH/S (S. di Hurler/Scheie) si caratterizza per un fenotipo intermedio fra le due forme sopra descritte; la malattia si manifesta nella seconda infanzia ed evolve lentamente, consentendo una sopravvivenza che si aggira tra i 20 e i 30 anni. L infiltrazione dei GAGs può verificarsi a vario livello: nel sistema liquorale intracranico, provocando idrocefalo ostruttivo e/o nella dura madre del tratto spinale, comportando compressione del midollo che può causare paresi spastica se non corretta tempestivamente con intervento neurochirurgico. Il coinvolgimento neurochiurgico, o quantomeno un adeguato follow-up neuroradiologico, si rendono necessari per il frequente riscontro nelle mucopolisaccaridosi tipo I e IV di ipoplasia del dente dell epistrofeo con conseguente instabilità della cerniera cervicale nei movimenti di flesso-estensione. Dal punto di vista laboratoristico si osserva l escrezione urinaria di eparan-solfato e dermatan-solfato dovuta al deficit dell enzima α-l-iduronidasi dosato sui leucociti o fibroblasti in coltura. L analisi molecolare del gene localizzato sul cromosoma 4 (4p16.3) consente di confermare la diagnosi. MUCOPOLISACCARIDOSI II (S. di HUNTER) E l unica mucopolisaccaridosi a trasmissione diaginica; l enzima carente è la iduronato-2-solfatasi. Clinicamente si distingue una forma grave ed una lieve; i sintomi della forma grave compaiono generalmente intorno al primo anno di vita e raggiungono la piena espressività a 3-4 anni. L affezione si caratterizza per i lineamenti grossolani del volto, la bassa statura, la rigidità articolare, l epatosplenomegalia, saltuariamente noduli sottocutanei ed un ritardo mentale grave. La disostosi multipla è meno accentuata che nella mucopolisaccaridosi I ed è assente l opacità corneale. La progressione è lenta e l exitus sopraggiunge intorno ai anni di vita. Nella forma lieve non è presente o è molto lieve il ritardo mentale; i problemi maggiori sono quelli a carico dell apparato cardiocircolatorio e uditivo. 8

12 Dal punto di vista laboratoristico si osserva l escrezione urinaria di eparan-solfato e dermatan-solfato dovuta al deficit dell enzima iduronato-2-solfatasi dosato sui leucociti o fibroblasti in coltura. L analisi molecolare del gene localizzato sul cromosoma X (Xq27-28) consente di confermare la diagnosi. MUCOPOLISACCARIDOSI III ( S. di SANFILIPPO) E la forma più frequente di mucopolisaccaridosi ed è dovuta a quattro distinti difetti enzimatici, tutti coinvolti nella degradazione dell eparan-solfato. Dal punto di vista clinico, si caratterizza principalmente per il ritardo mentale rapido e progressivo associato a lievi dimorfismi facciali; per quest ultimo motivo spesso la diagnosi viene formulata tardivamente. La manifestazione clinica predominante è il ritardo mentale grave associato a lieve dimorfismi facciali. Lo sviluppo psicomotorio è per lo più normale; successivamente si assiste ad un rallentamento, un arresto ed infine ad una regressione più o meno rapida associata ad un iperattività notevole che rende molto difficile la gestione di questi pazienti. Lo stadio finale è caratterizzato da demenza profonda spesso associata a convulsioni, atetosi e quadriplegia spastica. L exitus si verifica intorno ai anni. Sono stati riportati in letteratura rari casi con sintomatologia lieve. Gli esami di laboratorio mostrano un escrezione urinaria di eparan-solfato ed il dosaggio dell attività enzimatica sui leucociti o fibroblasti in coltura mostra un deficit di uno dei seguenti enzimi: eparan-n-solfatasi, α-nacetilglucosaminidasi, acetil-coa-alfa-glucosaminide-acetiltransferasi, N-acetil-alfaglucosamino-6-solfatasi. I geni sono stati localizzati rispettivamente sul cromosoma 17q25.3, 17q21, 8p11.1 e 12q14. MUCOPOLISACCARIDOSI IV (S. di MORQUIO) La malattia, caratterizzata da una displasia scheletrica e dall escrezione urinaria di cheratan-solfato, può essere determinata da due differenti difetti enzimatici: la 9

13 galattosamina-6-solfatasi (Mucopolisaccaridosi IV A) e la β-galattosidasi (Mucopolisaccaridosi IV B). Le prime manifestazioni cliniche si osservano fra i 18 e i 24 mesi e comprendono il ritardo dell accrescimento ed i segni iniziali della displasia ossea (valgismo delle ginocchia, protrusione dello sterno con conseguente deformazione della gabbia toracica, cifosi o scoliosi dorso-lombare). Il quadro clinico è completo intorno ai 4-6 anni. La testa, di dimensioni generalmente normali, incassata fra le spalle per la presenza del collo corto, contrasta con la restante parte del corpo; la facies è tipica con profilo piatto, naso corto, radice insellata, bocca ampia e mento prominente. Sono presenti anche opacità corneali, modesta riduzione uditiva e soffio cardiaco per coinvolgimento valvolare. Le grandi articolazioni sono voluminose e con mobilità limitata, mentre quelle metacarpo-falangee ed interfalangee sono iperestensibili (segno della doppia nocca ). Lo sviluppo staturale è gravemente compromesso con un altezza definitiva che si attesta tra i 115 e120 cm. Le due forme (A e B) sono pressoché analoghe, fatta eccezione per una espressività in genere meno severa della forma B. Fig. 3. Pazienti affetti da MPS tipo IV o Sindrome di Morquio La diagnosi di laboratorio si basa sulla valutazione dell escrezione del cheratansolfato nelle urine e sulla dimostrazione del deficit dell attività enzimatica sui leucociti o fibroblasti; è possibile l indagine molecolare di entrambi i geni 10

14 codificanti i due diversi enzimi, localizzati nella regione 16q24.3 e 3p21.33 rispettivamente. MUCOPOLISACCARIDOSI VI (S. di MAROTEAUX-LAMY) L affezione, causata dal deficit dell arilsolfatasi B, ricorda per caratteristiche cliniche e radiologiche la s. di Hurler, fatta eccezione per l assenza nei pazienti affetti da mucopolisaccaridosi VI del ritardo mentale. Di frequente riscontro è la compromissione cardiaca per interessamento valvolare. Il dosaggio urinario dei mucopolisaccaridi evidenzia una aumentata escrezione di dermatan-solfato e la diagnosi si basa sulla determinazione dell attività enzimatica e sull indagine molecolare del gene codificante l arilsolfatasi B, mappato a livello del cromosoma 5 (5q11-5q13). MUCOPOLISACCARIDOSI VII (S. di Sly) Questa affezione è dovuta al deficit dell enzima -glucuronidasi. I pochissimi casi descritti (circa 40) mostrano una variabilità della storia naturale rapportata alla gravità del quadro clinico; esistono, infatti, le forme ad esordio in epoca prenatale che si manifestano con idrope fetale e che causano spesso la morte in utero, le forme ad esordio in epoca neonatale associate a dismorfismi, ernie, epatosplenomegalia, disostosi, ipotonia e deficit neurologici che residuano in grave deficit cognitivo e bassa statura nei rari casi che sopravvivono ed infine le forme ad esordio in età adolescenziale o adulta che vengono scoperte a seguito di presentazione con cifosi toracica. La diagnosi differenziale è con le altre forme di mucopolisaccaridosi e con le oligosaccaridosi. MUCOPOLISACCARIDOSI IX (S. di Natowicz) Questa affezione è dovuta al deficit dell enzima ialuronidasi ed un solo paziente è stato riportato in letteratura con manifestazioni cliniche caratterizzate essenzialmente 11

15 da bassa statura e tumefazioni dolorose periarticolari e segni clinici quali ugola bifida e palatoschisi submucosale. La diagnosi di laboratorio è basata sulla dimostrazione del deficit enzimatico, rispettivamente -mannosidasi e -mannosidasi, effettuato su fibroblasti o leucociti DIAGNOSI Certamente non è facile orientarsi in questo complesso gruppo di affezioni, dal momento che le mucopolisaccaridosi presentano forme cliniche differenti per epoca d insorgenza, entità, progressione dei sintomi, e diversa compromissione dei vari organi ed apparati [3]. Tali segni sono spesso sfumati nei primi due anni di vita, rallentando la diagnosi e compromettendo l efficacia di una eventuale terapia. Di fondamentale importanza per la diagnosi sono un accurata anamnesi familiare e l attento esame clinico: il quadro clinico può però non essere evidente in fase precoce, specie in varianti lievi [3]. Il sospetto clinico è sempre e comunque il punto di partenza per l avvio alle corrette indagini strumentali, biochimiche e molecolari del paziente. I progressi della biochimica, l identificazione dei geni coinvolti, lo studio delle neuroimmagini, in particolare della risonanza magnetica, hanno portato all identificazione di sempre più pazienti. Nel sospetto di una malattia lisosomiale, esiste la possibilità di eseguire alcune indagini semplici e rapide di prima istanza: 12

16 - lo striscio di sangue periferico, che può dimostrare la presenza di linfociti vacuolati o cellule midollari con accumulo all interno; - una radiografia dello scheletro, che può evidenziare un quadro di disostosi multipla (sella a omega, coste a remo, vertebre a martello, metacarpi tozzi, grave gibbo dorso-lombare); - un esame oftalmologico, per verificare la presenza di eventuale opacità corneale, atrofia ottica o macchia rosso ciliegia; - consulenze specialistiche (odontoiatrica, otorinolaringoiatrica ecc). 13

17 La diagnosi definitiva infine si ottiene con l individuazione del substrato accumulato e la dimostrazione di uno specifico difetto enzimatico. La caratterizzazione del materiale accumulato si attua mediante campioni di urine, con il dosaggio ed indagine elettroforetica dei glicosaminoglicani. Il dosaggio degli enzimi lisosomiali si esegue essenzialmente sui leucociti e fibroblasti in coltura. La diagnosi biochimica deve, infine, essere confermata dall indagine molecolare. Tale tipo di analisi molecolare può essere eseguita anche su villi coriali e amniociti, consentendo un efficace counseling genetico ed una precisa diagnosi prenatale. Le nuove prospettive terapeutiche per alcuni difetti rendono indispensabile una diagnosi precoce TERAPIE ATTUALI La prognosi nella maggior parte delle mucopolisaccaridosi è assai severa sia in termini di mortalità sia in termini di morbilità, per cui vi è sempre stato un notevole impegno nell individuare una terapia in grado di modificare la storia naturale di tali affezioni [3]. Le attuali possibilità terapeutiche sono il trapianto di cellule staminali emopoietiche e la somministrazione dell enzima carente ricombinante. Il razionale del trapianto di midollo (Fig. 4) è rappresentato dalla possibilità di fornire ai malati una fonte costante e consistente dell enzima mancante. I monociti circolanti derivanti dalle cellule del donatore fuoriescono dai vasi, colonizzano i diversi organi ed apparati dell ospite, trasformandosi in macrofagi e quindi producendo l enzima 14

18 carente. Fig. 4. Il razionale del trapianto di midollo osseo nelle mucopolisacaridosi Attualmente l indicazione al trapianto esiste per la s. di Hurler: nel 1991 l International Society for the Correction of Genetic Disease by Transplantation ha proposto precisi criteri d eleggibilità al trapianto per i pazienti, ovvero età inferiore ai 3 anni, quoziente intellettivo superiore a 70, disponibilità di donatore HLA compatibile. La terapia enzimatica sostitutiva (ERT) è stata introdotta per la prima volta agli inizi degli anni 90 per la malattia di Gaucher tipo I; le altre malattie lisosomiali per le quali oggi è impiegata con successo sono la mucopolisaccaridosi I, II, VI, per le quali si assiste ad una modificazione del fenotipo della malattia con correzione o drastica riduzione dei GAGs urinari, una normalizzazione dell epatosplenomegalia e un miglioramento della mobilità articolare, in assenza di effetti collaterali. Recentemente il Nostro Centro ha pubblicato i risultati dei primi 5 anni di follow-up del più giovane paziente al mondo affetto da MPS I H/S che ha iniziato terapia in fase pre-clinica poiché fratello di affetta con diagnosi posta e che ad oggi non ha alcun segno di malattia [4]. Purtroppo gli enzimi ricombinanti, essendo macromolecole glicoproteiche, non passano la barriera ematoencefalica e ciò li rende inefficaci per le mucopolisaccaridosi con interessamento del sistema nervoso centrale. 15

19 E F Fig. 5. A) Paziente M a 5 mesi di vita B) Paziente F a 5 mesi di vita, 4 anni prima della diagnosi C) Paziente M a 5.5 anni, 5 anni dopo l inizio della terapia D) Paziente F a 5 anni, appena prima di iniziare terapia E) Paziente M oggi F) Paziente F oggi 2.4. TERAPIE FUTURE Per quel che concerne le prospettive terapeutiche nelle malattie lisosomiali incluse le mucopolisaccaridosi di recente è stata valutata l efficacia di farmaci in grado di inibire la sintesi delle macromolecole su cui agiscono gli enzimi lisosomiali o deprivazione di substrato, attualmente in uso in pazienti con sfingolipidosi ( malattia di Gaucher e Niemann Pick tipo C ) e proposto per la MPS II [5]. Ancor più recentemente è stato osservato un ruolo di stimolazione dell attività enzimatica residua da parte di piccole molecole che avrebbero un effetto stabilizzante o favorente il folding (cioè il ripiegamento) corretto sulle proteine mutate. Questo effetto è stato definito chaperone-mediated enzyme enhancement. Questa nuova strategia terapeutica è stata già usata in pazienti con altre malattie lisosomiali, quali Fabry e Pompe [6]. Il coinvolgimento del sistema nervoso rappresenta l ostacolo principale ad ogni trattamento per la presenza della barriera ematoencefalica. Studi 16

20 animali sono in corso per verificare l efficacia della somministrazione degli enzimi sostitutivi ad alte dosi per via intratecale [7]. Infine negli ultimi anni numerosi studi sono stai condotti sia in vitro sia su modelli animali per valutare l efficacia della terapia genica nelle malattie lisosomiali che ben si prestano trattandosi di disordini ben caratterizzati e dovuti a mutazioni di singoli geni [8]; in particolare sono state condotte ricerche in vivo su animali nelle mucopolisaccaridosi I, II, III, VI, VII. Il razionale di tale approccio si basa sul principio di trasferire il gene sano nelle cellule dei pazienti al fine di produrre l enzima mancante e conseguentemente ridurre le sostanze intralisosomiali accumulate. I risultati sperimentali al momento attuale sono incoraggianti, ma resta ancora molto da fare prima che si possano fare sperimentazioni sull uomo. 17

21 3. I GLICOSAMINOGLICANI I Mucopolisaccaridi (MPS) o Glicosaminoglicani (GAG), sono delle macromolecole eteropolisaccaridiche, che formano la sostanza fondamentale dei connettivi. Essi sono costituiti da uno scheletro proteico, con cui danno origine ai Proteoglicani e a cui sono unite, ad intervalli più o meno regolari, dalle catene polisaccaridiche non ramificate [9]. Proteoglicano GAGs Core proteico Ac. ialuronico Ogni singola catena polisaccaridica lineare è formata, a sua volta, da unità disaccaridiche fondamentali, rappresentate da un esosamina (glucosamina o galattosamina) e da un acido uronico (glucuronico o iduronico), ad eccezione del cheratansolfato in cui l acido uronico è sostituito da un esoso (galattosio). Tali GAGs, in base alla natura dei residui di esosamine, sono classificati in due gruppi. - Glucosaminoglicani (HA, KS, HS, eparina) - Galattosaminoglicani (CS, DS). 18

22 GLICOSAMINOGLICANI (GAG) Macromolecole polisaccaridiche lineari derivanti dalla ripetizione di numerose e specifiche unità disaccaridiche costituite ciascuna da: Acido uronico + Esosammina Ac. uronico Esosam. Ac uronico Esosammina - Ac. Glicuronico - Ac. Iduronico -Glucosammina -Galattosammina ACIDO JALURONICO Ac. glucuronico N-acetilgalattosammina-4-s N-acetilglucosammina CONDROITIN-SOLFATI Ac. Glucuronico o Ac. iduronico EPARAN - SOLFATO Ac. glucuronico 2-solfato Glucosammina 2,4-disolfata Le unità monosaccaridiche si uniscono tra loro per mezzo di un legame glicosidico che si forma tra il gruppo ossidrilico del carbonio anomerico (C-1) di un acido esuronico e il gruppo ossidrile di una esosamina. Questo legame viene chiamato uronosile. Le unità disaccaridiche così formate sono associate tra loro da un altro 19

23 legame glicosidico, chiamato esosaminile. Si ottengono così le lunghe catene che contraddistinguono i GAG. L elevata variabilità di queste macromolecole è anche determinata dalla presenza di gruppi solfato sugli atomi di carbonio 4 e 6 e dall acetilazione del gruppo amminico dell esosamina. In aggiunta, è possibile trovare unità disaccaridiche fondamentali di altre molecole affini. Ciò determina la loro struttura eteropolisaccaridica. Per tale motivo il peso molecolare dei GAG presenta un ampio range che varia da a In virtù dell alto contenuto di gruppi carbossilici (-COO-), gruppi solfato esterificati (-O-SO) i GAG sono polianioni; il numero di cariche negative per unità di disaccaride è 1 (nell acido ialuronico) fino ad un massimo di 4 (nell eparina). I GAG più ampiamente studiati sono: l acido ialuronico (HA); il condroitin solfato (CS); il cheratan solfato (KS); il dermatan solfato (DS); l eparina (Hep); l eparan solfato. ACIDO IALURONICO (HA) L acido Ialuronico, macromolecola lineare con un alto peso molecolare, ha una marcata capacità di legare l acqua. Questo conferisce a tale acido un ruolo importante 20

24 nel mantenere il turgore dell umor vitreo dell occhio e nel resistere alle tensioni da parte della cute e dell aorta. La catena di questo GAG è costituita dal ripetersi dell unità disaccaridica: acido D-glucuronico e N-acetil-D glucosamina unite da un legame (1-4). L acido Ialuronico differisce dagli altri GAG per l assenza di gruppi solfato e per non essere coniugato ad alcuna proteina. Interagisce con gli altri proteoglicani a formare aggregati che sono depositati nella rete di fibre collagene, così da restringere la mobilità dei proteoglicani stessi e da ridurre la loro esposizione agli enzimi idrolitici. CONDROITIN SOLFATI (CS-A e C) Il Condroitin Solfato si trova ampiamente distribuito in diversi tessuti connettivali, in particolare cartilagine, ossa e valvole cardiache. Come gli altri proteoglicani solfati, il CS, legandosi a molecole d acqua, riesce a distribuire uniformemente le forze esercitate dall esterno; importante quindi il suo ruolo nei tessuti connettivali sottoposti ad elevate pressioni, quali il nucleo polposo dei dischi intervertebrali e la cartilagine delle giunture. Un altra funzione dei proteoglicani solfati è quella di filtro. Grazie all elevato grado di idratazione, i sali e gli altri composti a basso peso molecolare possono diffondere attraverso il gel di proteoglicani, mentre non possono farlo le proteine. Inoltre questi GAG sono elementi costitutivi delle membrane basali. Partecipano anche al processo di calcificazione della cartilagine, in quanto inibiscono la cristallizzazione del solfato di calcio. Dal punto di vista chimico il CS è un eteropolimero non ramificato, costituito dal ripetersi del disaccaride acido β-d- 21

25 glucuronico e N-acetil-β-D-galattosamina uniti tra loro da un legame BETA (1-3). Le unità disaccaridiche sono a loro volta unite da un legame BETA (1-4).Questi GAG possono presentare sul residuo galattosaminico un gruppo solfato in posizione C-4 (condroitin-4-solfato o condroitin solfato A) o in posizione C-6 (condroitin -6-solfato o condroitin solfato C), che ne complicano notevolmente la struttura. Il primo è particolarmente presente a livello della cartilagine, nei tendini, nelle valvole cardiache e a livello del nucleo polposo dei dischi intervertebrali. CHERATAN SOLFATO (KS) Il Cheratan Solfato si trova nella cartilagine, dove è aggregato con il Condroitin Solfato, nei dischi intervertebrali, ossa e cornea. Sulla base dei tessuti d origine possiamo distinguerlo in due tipi: il Cheratan Solfato I o corneale (KS I) ed il Cheratan Solfato II o scheletrico (KSII). Entrambi presentano la stessa struttura disaccaridica, ma differiscono per il tipo di legame con l amminoacido treonina nel formare il proteoglicano corrispondente. Il disaccaride ripetitivo del Cheratan Solfato è costituito dal galattosio legato BETA (1-4) ad una molecola di N-acetilglucosamina. Il residuo di glucosamina lega un gruppo solfato in posizione 6. Le unità disaccaridiche sono unite da un legame Beta (1-3). 22

26 DERMATAN SOLFATO(DS o CSB) IL Dermatan Solfato, (definito anche Condroitin Solfato B), è un epimero del Cheratan Solfato dal momento che nell unità disaccaridica, al posto dell acido Uronico, si trova l acido L-iduronico. Perciò il disaccaride risulta formato dall acido-l-iduronico legato ALFA (1-3), o BETA (1-3) in presenza di acido-diduronico, all N-acetilglucosamina. Il residuo galattosaminico è solfato in posizione C-4. I disaccaridi sono legati tra loro da un legame BETA (1-4). Il peso molecolare del Dermatan Solfato è simile a quella del Condroitin Solfato, ma generalmente la catena del primo è più lunga. Il DS è stato trovato nella cute, nella parete dei vasi e nelle valvole cardiache. I GAG contenenti acido L-iduronico, oltre al Dermatan Solfato, l Eparan Solfato e l Eparina, formano complessi insolubili con le lipoproteine a bassa densità (LDL) del siero; ciò potrebbe favorire la formazione di polacche aterosclerotiche. EPARINA (Hep) L Eparina ha una struttura molto più complessa di quella degli altri GAG precedentemente descritti. Questo GAG contiene sia acido Iduronico che acido 23

27 Glucuronico ed, in aggiunta, il residuo glucosaminico può essere legato ad un gruppo solfato o acetilato. Al confronto con altri GAG, l Eparina è molto più solfatata, contenendo fino a tre gruppi solfato per disaccaride, che le conferiscono una notevole variabilità strutturale. Le unità ripetitive di Eparina sono costituite da acido-dglucuronico ( o L-iduronico) legato BETA (1-4), o ALFA (1-4) in presenza di acido L-iduronico, legato alla D-glucosamina. I disaccaridi sono tra loro uniti tramite un legame BETA (1-4). L aminogruppo nella glucosamina può essere sia solforato che acetilato. L Eparina si trova come principale componente dei granuli intracellulari delle mastcellule presenti nelle arterie del polmone, del fegato e della cute. EPARAN SOLFATO (HS) L Eparan Solfato è strettamente correlato all eparina, per il fatto che contiene gli stessi costituenti monosaccaridici, legati l uno all altro nella medesima modalità dell Eparina. Tuttavia ne differisce strutturalmente perché, rispetto a quest ultima, contiene meno gruppi solfati e meno molecole di acido L-iduronico. L Eparan Solfato si trova a livello delle membrane basali, tra i componenti di superficie delle cellule. 24

28 GAG Acido Ialuronico Condroitin Solfato Eparan solfato Eparina Dermatan solfato Cheratan solfato LOCALIZZAZIONE Liquido sinoviale, umor vitreo, matrice extracellulare e tessuto connettivale Cartilagine, ossa, valvole cardiache Membrane basali, componenti di superficie della cellule Componente dei granuli intracellulari di mastcellule nelle arterie di polmoni, fegato e cute Cute, vasi sanguigni, valvole cardiache Cornea, ossa, cartilagine aggregata con condroitin solfato 3.1. CATABOLISMO DEI GLICOSAMINOGLICANI La degradazione dei GAG avviene prevalentemente a livello lisosomiale, dove la maggior parte dei frammenti e dei monosaccaridi generati rientra nella via biosintetica. In vivo il processo degradativo è altamente organizzato e dipendente da idrolasi. Tali enzimi sono substrato-specifici in accordo con la stereoisomeria dello zucchero, con il tipo di legame glicosidico, con il pattern di sostituzione idrossilica della catena e con il ph del compartimento lisosomiale. La prima classe di questi enzimi è costituita da esoglicosidasi che catalizzano la liberazione dello specifico monosaccaride all estremità non riducente della catena oligosaccaridica. Le endoglicosidasi idrolizzano invece specifiche sequenze glucidiche all interno del biopolimero generando frammenti di circa 10 kda. Al processo idrolitico cooperano anche delle solfatasi, delle esosaminidasi e delle glucuronidasi. Nella tabella sottostante sono riportati solo alcuni enzimi responsabili del catabolismo dei GAG. 25

29 Enzima Iduronato-2-solfatasi Reazione Idrolisi del gruppo 2-solfato in L-iduronato di DS e HS α-iduronidasi Idrolisi di legami iduronosidici non solfatati in DS GalNAc-4-solfatasi Idrolisi del gruppo 4-solfato di GalNAc4S e di GalAGs GalNAc-6-solfatasi Idrolisi del gruppo 6-solfato di GalNAc6S (CS) e di D-gal (KS) β-n-acetilesosaminidasi Rimozione di GalNAc4S alla porzione terminale non riducente β-glucuronidasi Rimozione dei residui di β-glca Ad ogni modo è necessario considerare che l attività di questi enzimi è strettamente interconnessa e variabile in funzione dell ampia varietà di GAGs presenti ANALISI DEI GLICOSAMINOGLICANI A seconda del tipo di MPS ed in relazione alla severità della clinica, diversi glicosaminoglicani ad alto peso molecolare [10,11] così come diversi frammenti [12,13] si accumulano nei tessuti e vengono escreti nei fluidi biologici, in particolare sangue e urine. Tuttavia, pur dando indicazioni sulla severità della malattia, ad oggi, 26

30 i livelli di GAGs urinari valutabili attraverso le metodiche disponibili, non possono essere utilizzate come attendibili indicatori di severità [14]. Inoltre, la correlazione genotipo-fenotipo è stata limitata dalla rarità dei disordini e dal grande numero di mutazioni [15]. Ancora, la severità clinica associata alle mutazioni missenso e ad altri tipi di mutazioni ha reso difficile la predizioni per altri tipi di MPS [10, 11]. Come conseguenza, sarebbe auspicabile avere un singolo approccio analitico per misurare la quantità anomala di GAG nelle urine e le differenze qualitative tra le varie classi di queste molecole come modificazioni relative ai diversi tipi di MPS. Inoltre, un simile approccio di laboratorio sarebbe utile per mettere a punto uno screening da inserire nei programmi di salute pubblica per l individuazione preventiva della patologia, diagnosi e trattamento di queste malattie metaboliche congenite che possano condurre a una significativa riduzione in termini di morte, malattia e disabilità associate. In ultimo, un più accurato follow-up dei trattamenti e nuovi possibili interventi terapeutici potrebbero essere monitorati da queste nuove applicazioni analitiche. Il dosaggio dell attività enzimatica basato sulla coltura di fibrobalsti, leucociti, plasma e siero sono considerati definitivi per uno specifico disordine di MPS ed è prassi standardizzata per la diagnosi. Tuttavia, nessuno dei molti approcci sviluppati a questo scopo, come il dosaggio multiplo diretto degli enzimi lisosomiali in spot di sangue essiccato attraverso la spettrometria (MS) tandem mass (MS/MS) [16] o il dosaggio multiplex immuno-quantitativo di proteine lisosomiali da spot di sangue secco su carta da filtro, sono utili per la diagnosi precoce di MPS nello screening neonatale a causa delle complesse procedure e della complessità dell attrezzatura richiesta. D altra parte, ci sono molte procedure per la diagnosi di MPS basate sulla valutazione di GAG accumulati, come la misura dei GAG totali urinari attraverso un dosaggio colorimetrico [17, 18] o l elettroforesi in acetato di cellulosa [19]. Tuttavia, i dosaggi colorimetrici sono generalmente usati per ottenere una valutazione quantitativa, ma sono incapaci di individuare i singoli GAG e tipo di MPS e l elettroforesi non è in grado di valutare la relativa struttura polisaccaridica e le 27

31 caratteristiche utili per la caratterizzazione di specifiche modificazioni. Il metodo ELISA è stato sviluppato per la valutazione quantitativa e qualitativa di HS e KS nel sangue e nelle urine [20]. In ogni caso, la misura del DS non è possibile per l incapacità di valutare la sua composizione (come per HS e KS). Le tecniche basate sulla ionizzazione elettrospray e la tandem mass (ESI)-MS sono state usate per analizzare oligosaccaridi, monosaccaridi e disaccaridi di GAG in campioni biologici [21]. Tuttavia, questo approccio generalmente richiede tempo e preparativi complessi e procedure di marcatura effettuate prima dell analisi, oltre a un equipaggiamento costoso. E stato pubblicato un metodo HPLC-ESI-MS/MS capace di evidenziare la quantità nell ordine di nanomoli di HS, DS e derivati disaccaridici di KS nel siero e plasma di pazienti MPS [22, 23]. Questo approccio richiede la digestione di campioni di GAG per ottenere disaccaridi tramite l uso di varie liasi prima dell analisi, che è potenzialmente costosa e richiede tempo. Inoltre, un nuovo dosaggio RPHPLC-ESI- MS/MS per la determinazione di derivati intatti di DS e HS da disaccaridi a pentasaccaridi è stato recentemente descritto per la diagnosi di MPS [24]. Un importante inconveniente di questa analisi è l incapacità di determinare GAG urinari ad alto peso molecolare, presenti in alta concentrazione nelle urine MPS [13], come il tempo richiesto e la complessa preparazione di campioni e la derivatizzazione con 1- phenyl-3-methyl-5-pyrazolone. In definitiva, tutte queste metodiche non sono appropriate per lo screening di massa dal momento che sono eccessivamente costose per l alto costo della strumentazione e in ogni caso non sono mai state capaci di trovare una correlazione analitica tra la diagnosi clinica e la severità dell MPS. Per quel che concerne la terapia, i soli parametri biochimici usati per monitorare l efficacia di terapia nei soggetti affetti da MPS sono stati valutati nelle urine con il metodo quantitativo generico del DMB e l elettroforesi su acetato di cellulosa [4] o attraverso la valutazione dei disaccaridi dei GAGs plasmatici e urinari mediante HPLC-ESI [25]. Detto ciò, il il complesso sierico trombina-cofattore II dell eparina è stato proposto come biomarker per monitorare l efficacia di trattamento delle MPS 28

32 [26] insieme con la determinazione dei diasaccaridi dei GAGs plasmatici e urinari [27]. Comunque sia, questi approcci analitici sono incapaci di rilevare in modo diretto modificazioni strutturali di GAG. 29

33 4. SCOPO DELLO STUDIO Emerge l importanza della diagnosi precoce delle mucopolisaccaridosi in quanto, oltre a costituire la base per la formulazione del consiglio genetico alla famiglia, è il presupposto fondamentale per consentire un precoce approccio terapeutico prima che si siano verificati danni irreversibili in quelle malattie per le quali è attualmente disponibile una terapia efficace. A tal proposito, nuove frontiere si stanno varcando nell ambito della ricerca, per quel che concerne le terapie attuali e quelle future, pertanto emerge la necessità di un attenta valutazione del trattamento allo scopo di ottimizzarne l impiego, valutarne i rischi e monitorarne l efficacia. Il presente lavoro, attraverso la modifica di metodi di laboratorio già noti (dosaggio e caratterizzazione dei GAG) e la messa a punto di nuovi approcci metodologici (valutazione e rapporto delle esosamine derivate dai GAG, determinazione dei disaccaridi urinari), consente la caratterizzazione dei glicosaminoglicani urinari per l applicazione alla diagnosi e. Infine, tale lavoro potrebbe in futuro consentire la determinazione dei valori normali di GAG in epoca neonatale permettendo l identificazione in fase precoce ossia preclinica delle mucopolisaccaridosi (screening neonatale). Nei nostri dati preliminari, presentiamo delle procedure nuove ad alta risoluzione per la determinazione delle esosamine contenute nelle urine mediante due differenti metodologie: Elettroforesi Capillare in UV e HPLC in fluorescenza. I risultati ottenuti con entrambi i metodi confermano l esistenza di una correlazione tra concentrazione di esosoamine urinarie e contenuto in glicosaminoglicani. Inoltre è stata impiegata una procedura d analisi già nota, la misurazione dei disaccaridi con HPLC in UV, ma mai applicata sinora allo studio dei glicosaminoglicani umani. Tale procedura analitica viene applicata al monitoraggio della terapia al fine di ottimizzarne l efficacia. Correlazioni importanti tra la risposta dell analisi, la diagnosi clinica, la gravità di malattia e l efficacia della terapia enzimatica sostitutiva sono state anche osservate. 30

34 Infine, i risultati di questo studio possono essere utili in previsione di uno screening neonatale impiegato nei programmi di salute pubblica preventiva, oltre che nell ambito di un possibile impiego per un più accurato follow-up del trattamento terapeutico attuale e per una più attenta valutazione degli eventuali interventi terapeutici futuri. 31

35 5. MATERIALI 5.1. PAZIENTI Sono stati raccolti i campioni di urina di : - 83 volontari sani, di età compresa fra un mese e 13 anni, senza deficienze enzimatiche comparabili a MPS (gruppo di controllo); - 45 soggetti affetti da varie forme di MPS con sottotipi lievi e gravi ( 6 MPS I Sheie, 1 MPS I Hurler/Sheie, 7 MPS I Hurler, 4 MPS II lieve, 7 MPS II severa, 12 MPS III, 7 MPS IV, 1 MPS VI) seguiti presso la Clinica Pediatrica di Ancona. Sono inoltre stati raccolti i campioni di urine di: - 2 pazienti affetti da MPS I Hurler/Sheie in trattamento con α-l-iduronidasi da oltre 6 anni, prima dell infusione e dopo l infusione, per un periodo complessivo di valutazione di 2 settimane; - 1 paziente affetto da MPS II forma severa in trattamento con iduronato-2- solfatasi, prima dell inizio della terapia e durante la terapia, per un periodo complessivo di valutazione di 10 mesi. 32

36 6. METODI Sui campioni di urina raccolti dei soggetti controllo e di quelli affetti da vari tipi di MPS è stata effettuata una valutazione quantitativa preliminare dei GAG totali con un dosaggio standard colorimetrico accettato dalle linee guida per la gestione di MPS [28] presso il Laboratorio di Diagnosi e Prevenzione delle Malattie Metaboliche della Clinica Pediatrica di Ancona, insieme al dosaggio dei livelli di creatinina, e la caratterizzazione dei mucopolisaccaridi urinari tramite elettroforesi su acetato di cellulosa in Bario-acetato per l identificazione del pattern di escrezione [29]. Per i pazienti MPS, sono stati anche eseguiti un accurata caratterizzazione enzimatica dell enzima mancante, insieme alla definizione del tipo di MPS e alla valutazione clinica ad opera dei medici della Clinica Pediatrica di Ancona. I campioni di urina sono successivamente stati spediti al Dipartimento di Biologia di Modena, per uno screening delle esosamine. Sui campioni di urina raccolti dei 2 pazienti MPS I H/S e del paziente MPS II in terapia è stata effettuata una valutazione qualitativa e semi-quantitativa preliminare dei GAG totali con il metodo dell analisi elettroforetica in gel d agarosio [30] e successivamente una valutazione dei disaccaridi con metodo in HPLS/UV dopo digestione enzimatica, per un più accurato follow-up dei trattamenti. Tutte le analisi sono state condotte presso il Dipartimento di Biologia di Modena. 6.1.DOSAGGIO QUANTITATIVO DEI GAG URINARI COL METODO AL DMB Il metodo spettrofotometrico sfrutta la proprietà del colorante basico DMB di legarsi ai gruppi solfato delle molecole dei GAGs, formando un complesso colorato dall azzurro al lilla, di intensità proporzionale alla concentrazione dei GAGs nella soluzione. Il dosaggio viene eseguito in triplicato, si preparano per ciascun campione 3 cuvette contenenti quantità crescenti di urina (50, 100, 150 µl), e acqua distillata 33

37 fino a un volume di 500 µl. Vengono poi allestite due cuvette contenenti acqua distillata (bianco campione) e 3 cuvette contenenti una soluzione standard di Condroitin Solfato A (CS-A) alla concentrazione di 2,5 µg/10 µl. Vengono poi aggiunti 2,5 ml di colorante al DMB la cui composizione viene di seguito indicata: - 16 mg di 1,9 Dimetil-Metilene Blu, - 2 g di formiato di sodio, - 5 ml di etanolo assoluto, - 2 ml di acido formico, - acqua distillata fino a un volume finale di 1500 ml. Di ciascuna cuvetta viene letta l assorbanza alla lunghezza d onda di 535 nm tramite uno spettrofotometro a doppio raggio (Shimadzu), che permette di svolgere contemporaneamente la misura dell assorbanza del campione contro quello del bianco e permette di compensare qualunque fluttuazione dell intensità della sorgente luminosa durante una serie di misure. Le misure di densità ottica così ottenute, in relazione allo standard di riferimento, permettono di ottenere la concentrazione dei GAGs nel campione analizzato. L escrezione urinaria dei GAG viene poi espressa come rapporto µg GAG/mg Creatinina. 6.2.CARATTERIZZAZIONE DEI GAG URINARI TRAMITE ELETTROFORESI SU ACETATO DI CELLULOSA Il volume di urina da utilizzare per la caratterizzazione elettroforetica viene calcolato sulla base del valore del DMB/Creat. come segue μg di GAG in rapporto ai mg di Urina utilizzata creatinina <30 μg/mg 10 ml di urina 34

38 30-60 μg/mg 7,5 ml di urina +2,5 ml di H2O 60-90μg/mg 5 ml di urina +5ml di H2O >90μg/mg 2,5 ml di urina +5ml di H20 Purificazione dei GAGs urinari Si procede a questo punto con l isolamento dei mucopolisaccaridi mediante precipitazione con Cloruro di Cetilpiridinio(CPC), seguita da un lavaggio con acetato di potassio, un lavaggio con etanolo assoluto e uno con dietiletere. Il sedimento viene posto in stufa a 37 C e successivamente risospeso in 100 µl di H2O distillata. Di seguito lo schema del processo di estrazione: campione + 200µl di CPC al 10% Lasciare a 4 C overnight Centrifugare 4000 rpm per 10 a 4 C Scartare il sovranatante Aggiungere al pellet 10 ml di K-Ac al 10% in EtOH 95 Centrifugare 4000 rpm per 10 a 4 c Scartare il sovranatante Aggiungere al pellet 10 ml di EtOH assoluto Centrifugare 4000 rpm per 10 a 4 C Scartare il sovranatante Aggiungere al pellet 1 ml di dietiletere 35

39 Centrifugare 4000 rpm per 10 a 4 C Scartare il sovranatante Lasciare asciugare il sedimento in stufa a 37 C Risospendere il pellet in 100 µl di H2O dist. Per la corsa elettroforetica, i campioni sono stati seminati al catodo direttamente su strisce di Acetato di cellulosa in tampone Bario Acetato 0.05 M. Tra i due elettrodi viene applicata una differenza di potenziale di 150 V per 60 min. Le strisce di acetato di cellulosa vengono poi poste in una soluzione colorante contenente DMB allo 0,02% e CH3COOH all 1% per circa 10 minuti e successivamente decolorate in CH3COOH al 10% semina elettroforetica + KS CS DS - HS 6-3. DOSAGGIO DELLE ESOSAMINE Preparazione del campione Si parte da soluzioni standard di Glucosamine e Galattosamine alla concentrazone di 10 mg/ml in acqua bidistillata. Un campione di 500 µl di campione di urine viene centrifugato a giri per 10 minuti, viene prelevato il surnatante e poi 1 ml di 36

40 etanolo viene aggiunto a 200 µl di surnatante. Dopo 2 ore a -20 C, il campione viene centrifugato a giri per 10 minuti e il pellet viene dissolto in 500 µl di 4 Molare di HCL preparato fresco. Dopo 120 minuti a 110 C, il campione viene liofilizzato. Derivazione delle esosamine con acido antranilico o 2-aminobenzoico (AA) Le soluzioni di glucosamine e galattosamine standard liofilizzate o i campioni trattati, in presenza di standard interno ribosio, vengono dissolti in 50µL di sodio acetato all 1% e 50 µl di AA (30 mg) e sodio cianoboroidruro (20 mg) dissolti in1 ml soluzione di metanolo-acetato-borato (120 mg di sodio acetato e 100 mg di acido borico in 5 ml di metanolo) [15]. Le provette contenenti i campioni vengono scaldate a 80 C per 60 minuti. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, i campioni vengono analizzati da CE e HPLC. Elettroforesi Capillare Lo strumento per l EC è Beckman HPCE (P/ACE System 5000) equipaggiato con un rilevatore UV settato a 214 nm. La separazione e l analisi sono realizzate con una colonna capillare in silice (50 µm i.d., lunghezza totale 85 cm, e 65 cm dal punto di iniezione al rilevatore) a 25 C. Il tampone di corsa è composto da 150 mm di acido borico e 50 mm di NaH2PO4 tamponato a ph 7 con una soluzione di NaOH. Prima di ogni corsa, il capillare viene lavato con 0.1 M NaOH per un minuto e acqua bidistillata (o pura) per 2 minuti, e poi condizionato con il tampone di corsa per 2 min. Dopo ogni corsa, il capillare viene ritrattato con 0.1 Molare NaOH per 1 minuto e poi condizionato con tampone di corsa per 2 minuti. I campioni vengono iniettati automaticamente, usando un modo di iniezione a pressione, in cui il campione è pressurizzato per 5 sec. L elettroforesi viene condotta a 15kV (circa 60µAmper) usando una polarità normale. Le aree di picco sono calcolate usando il sistema software Beckman Gold V