Il ruolo del genetista nei programmi di diagnosi prenatale

Transcript

1 Il ruolo del genetista nei programmi di diagnosi prenatale Dr.ssa Eva Pompilii GynePro Medical Group Bologna U.O. Ostetricia e Ginecologia Policlinico S. Orsola Malpighi Bologna

2 Consulenza genetica... il ruolo del genetista clinico è quello di stabilire (o verificare) una diagnosi accurata su cui basare la consulenza e definire prognosi e follow-up, identificare il rischio di trasmettere la malattia ed le modalità con le quali questa può essere prevenuta o controllata. Questo processo è di tipo comunicativo e deve essere in grado di fornire adeguato supporto nella comprensione del significato della malattia genetica e sulle conseguenti decisioni da affrontare (mod. da ( 1994 Kingston,...è un vero e proprio atto medico

3 CONSULENZA GENETICA PRENATALE Positività/alterazione combinato test Presenza di anomalie all esame cromosomico eseguito su villi coriali/liquido amniotico Presenza di malformazioni all ecografia Rischio teratogeno in seguito ad assunzione di farmaci/esposizione a radiazioni ionizzanti

4 Diagnosi prenatale - Il riscontro di una condizione genetica (o non genetica) nel feto non permette generalmente alcuna terapia in utero - Può, in alcuni casi, essere utile per una migliore gestione del caso in epoca neonatale - Nella maggioranza dei casi, quindi, pone la questione dell interruzione (volontaria / terapeutica ) della gravidanza (L. 194/78)

5 Predizione ed incertezza Non in tutti i casi la diagnosi prenatale genetica fornisce un dato incontestabile

6 Predizione ed incertezza Non in tutti i casi la diagnosi prenatale genetica incontestabile comporta una prognosi prevedibile (malattia/non malattia)

7 Mosaico cromosomico Donna di 39 anni, si sottopone a villocentesi per rischio età materna Esito del cariotipo fetale: cariotipo maschile a mosaico costituito da linea cellulare normale e da linea cellulare primaria (16%) Esegue Amniocentesi: 47,XY,+21[4]/46,XY[29] (12%) Esegue Funicolocentesi: 47,XY,+21[6]/46,XY[94] (6%) Counselling genetico: rischio Down 6% circa?

8 Predizione ed incertezza Non in tutti i casi la certezza di malattia è percepibile come una disabilità insopportabile

9 Espressività variabile Donna di 25 anni, si sottopone a CVS per rischio di ricorrenza di neurofibromatosi di tipo 1 (50%). Il coniuge è affetto: presenta chiazze caffè-latte multiple, un numero moderato di neurofibromi (8), amartomi iridei. La diagnosi prenatale conferma la presenza della mutazione paterna. Prognosi:? (50% disturbi di apprendimento; 10% tumori maligni dei nervi periferici; 2% displasia tibiale; 2% glioma ottico sintomatico)

10 60 Anni MICROSCOPIA OTTICA: osservazione diretta dei cromosomi bandeggiati con colorazione Giemsa. Limite di risoluzione di 5-10Mb (550 bande). 80 Anni FISH (Fluorescence In Situ Hybridization): sonde sito-specifiche, marcate con fluorescenza. Necessarie informazioni a priori sulla localizzazione del riarrangiamento. Risoluzione fino ad 1Mb 90 Anni CGH (Comparative Genomic Hybridization): ibridazione competitiva di DNA genomico di un paziente e di un controllo, frammentati e marcati con un fluorocromo diverso, su metafasi di un soggetto sano. Risoluzione di qualche Kb. Anni 2000

11 Cariotipo FISH CGH-array analisi di sequenza Singolo gene Tutti gli esoni codificanti/ Intero genoma

12 CARIOTIPO STANDARD Identifica anomalie strutturali bilanciate e sbilanciate (traslocazioni, inversioni, cromosomi ad anello, isocromosomi, delezioni, duplicazioni) e anomalie numeriche ma risoluzione di circa 5-8Mb E POSSIBILE UNA RISOLUZIONE CITOGENETICA MAGGIORE?

13 La Citogenetica Molecolare FISH Permette un analisi mirata di una regione cromosomica consentendo di mettere in evidenza riarrangiamenti di alcune centinaia di chilobasi. Tale identificazione avviene mediante sonde marcate impiegando fluorocromi che emettono a diverse lunghezze d onda.

14 Principali applicazioni diagnostiche della FISH 1. Diagnosi delle sindromi da microdelezione o da microduplicazione 2. Studio delle delezioni subtelomeriche 3. Caratterizzazione di marker cromosomici 4. Caratterizzazione di riarrangiamenti cromosomici, sia bilanciati che sbilanciati 5. Determinazione della percentuale di mosaicismi cromosomici

15 L array CGH e una nuova tecnologia che consente di evidenziare variazioni del numero di copie nell intero genoma Cariotipo Array CGH - risoluzione +

16 CNV = Copy Number Variants = Copy Number Variation Segmenti di DNA >1kb presenti nel genoma con un numero variabile di copie (delezioni/duplicazioni) La risoluzione elevata dell array CGH ha determinato una maggiore identificazione di varianti complicando talvolta l interpretazione dei risultati Il 5-10% del genoma umano e variabile nel numero di copie in individui NORMALI

17 La complessità del genoma rende difficile stabilire la natura delle CNVs: differenze fenotipiche tra gli individui ruolo evolutivo patogenesi di malattie, sia mendeliane che multigeniche predisposizione ad alcune malattie BENIGNE PATOLOGICHE PREDISPONENTI

18 CNV Found in healthy individuals? * BENIGN YES NO PATHOGENIC YES Region associated with a known YES syndrome? AND/OR Parents tested? NO Disrupts gene(s) with a clear functional link to phenotype? NO YES UNCLEAR CLINICAL SIGNIFICANCE (likely pathogenic) BENIGN YES Inherited from an healthy parent? NO UNCLEAR CLINICAL SIGNIFICANC E *

19 Novel microdeletion/duplication syndromes: Rearrangement Size Phenotype 1 del / dup 1q Mb 2 del 1q kb ASSOCIATED with variable pediatric phenotype (MR, congenital anomalies, autism) ASSOCIATED with TAR (Thrombocytopenia Absent Radius) syndrome 3 del 15q Mb MR, dysmorphisms, epilepsy 4 del 15q24.1-q Mb MR, multiple congenital anomalies 5 del / dup 16p Mb 6 del/dup 16p kb MR, autism, dysmorphisms, behavioral problems (Rubinstein-Taybi region) ASSOCIATED with ASD, severe early-onset obesity (incomplete penetrance and variable phenotype 7 del / dup 17q Mb Diabetes, renal disease, epilepsy 8 del 17q kb MR, congenital anomalies, epilepsy

20 Quali possono essere le cause della presenza di un quadro clinico in un individuo portatore di un riarrangiamento de novo bilanciato? -I punti di rottura del riarrangiamento interrompono un gene che determina una malattia a trasmissione autosomica dominante. -Effetto di posizione. -Problemi legati alla presenza di UPD. -Il riarrangiamento è solo apparentemente bilanciato ma nasconde una perdita o una acquisizione di materiale genomico non visibile al cariotipo standard.

21 Limiti della consulenza in caso di riarrangiamenti bilanciati de novo Si può dare solo un rischio empirico Non è possibile definire un fenotipo e conseguentemente una prognosi Tempi stretti sono possibili caratterizzazioni ulteriori a livello molecolare dei punti di rottura? Se necessario offrire la ricerca della Disomia Uniparentale

22 Caso clinico Banda cromosomica Oligo non deleto (Mb) Inizio delezione (Mb) Fine delezione (Mb) Oligo non deleto (Mb) Dimensione (Mb) 3q13.11q , , , ,826 10,2 Feto con cariotipo 46,XX,t(3;10)(q27;q22) (liquido amniotico)

23 Donna di 37 anni, PARA grav. Esegue tri test: pos AF: dup 8 confermata con FISH 46,XY,?dup(8)(p23.2)ish(8)( wcp8+,d8s504+) Eseguito cariotipo nei coniugi : signora portatrice medesima duplicazione Bimbo riferito in buona salute 2 grav. AF: dup 8 materna Bimba riferita in buona salute 3 grav. Aborto spontaneo

24 4 grav. CVS in altro lab pertanto eseguita conferma cariotipo sulla mamma No duplicazione cr. 8 Eseguito Array-CGH: delezione interstiziale del braccio lungo del cromosoma 7 a livello della banda 7q11.22 Eseguito Array su CVS: confermata delezione gene AUTS2, variazioni nucleotidiche in tale gene, alcune delle quali riguardanti solo regioni non codificanti, sono associate a disordini dello spettro autistico (ASDs) e disordini neurologici, quali deficit di attenzione, iperattività, epilessia, dislessia, disturbi motori, ritardo del linguaggio, microcefalia e il consumo di alcol.

25 Caso clinico Donna di 33 anni, in buona salute, primigravida Non consanguineità con il partner; storia familiare negativa per ritardo mentale, malformazioni congenite, poliabortività. Villocentesi presso un centro privato senza specifica indicazione: Riscontro di traslocazione apparentemente bilanciata tra cromosoma 1 e 8, con formula 46,XY,t(1;8)(p36.3;q24.1) Cariotipo dei genitori nella norma (traslocazione de novo)

26 Effettuato array-cgh con risoluzione media di 250 Kb su DNA fetale estratto dai villi: Riscontro di una delezione di circa 390Kb nella regione 8q23.3q24.11 (a livello di uno dei breakpoint), contenente un singolo gene (EIF3H) Quali implicazioni???

27 EIF3H codifica per la subunità H del fattore di inizio traduzione EIF3. Ruolo cruciale nel processo di traduzione dell'mrna in proteina ed è infatti altamente conservato nel corso dell'evoluzione. Database: la delezione in questione non è descritta né come polimorfismo né come associata a quadri patologici. Pubmed: attribuito un ruolo patogenetico all'over-espressione del gene, ma solamente in associazione ad alcune forme tumorali (cancro colonrettale). Nessuna segnalazione riguardo la delezione/inattivazione del gene nell'uomo... Un solo articolo associa l'inattivazione del gene a problemi nello sviluppo embrionale su un modello animale (zebrafish), ma si tratta di una loss of function completa, mentre la delezione nel caso in esame è in eterozigosi...

28 Donna di 43 anni, in buona salute, quartigravida Non consanguineità con il partner; storia familiare negativa per ritardo mentale, malformazioni congenite, poliabortività. I grav: nasce una bimba che muore a 6 mesi di vita con diagnosi di RENE POLICISTICO RECESSIVO (25% rischio per ogni gravidanza) Test genetico nella bimba: conferma la diagnosi Confermato stato di portatori nei genitori II grav: CVS per cariotipo e diagnosi molecolare per Rene Policstico Bimbo affetto da Rene Policistico Infantile e riscontro di Trisomia 21 III grav: aborto spontaneo IV grav: in occasione del villo coriale riscontro ecografico di Oloprosencefalia lobare; cvs mostra Trisomia 18 e l analisi molecolare mostra un feto affetto da Rene Policistico Quale potrà essere la percezione del rischio per i signori???

29 Conclusioni La diagnosi genetica prenatale: a. è un percorso individuale (= di coppia) b. non ammette generalizzazioni c. necessita di un appropriata informazione (counselling) pre- e post-test d. ha implicazioni differenti secondo la categoria di malattie per cui viene richiesta e. avrà certamente importanti cambiamenti negli anni futuri (più dati da gestire!)

30 Mente genetica in un era genomica GRAZIE!!!