IVD. IVD Diagnostici in Vitro. FSHR/LHR Screen

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1 IVD IVD Diagnostici in Vitro FSHR/LHR Screen Genotipizzazione molecolare di Asn680Ser, Thr307Ala, Asp567Asn in FSHR e R554X in LHR attraverso Multiplex PCR / elettroforesi capillare Codice MDS-FSLR-001 Fabbricante: Orga Bio Human S.r.l. 50 Reazioni Store at -18 C to -25 C Data sheet, Revisione 1.1 (02/05/2014) 1 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

2 INTRODUZIONE L FSH è una gonadotropina che determina lo sviluppo delle cellule germinali. I recettori di questo ormone si trovano nell ovaio, sulle cellule della granulosa e il loro numero varia nelle diverse fasi del ciclo mestruale. L FSH agisce sulle cellule della granulosa potenziando il sistema aromatasico (citocromo P450) inducendo la sintesi di ormoni estrogeni a partire dagli androgeni prodotti dalle cellule della teca. L LH è una gonadotropina adenoipofisaria che promuove la maturazione follicolare e l ovulazione, induce la formazione del corpo luteo e stimola la secrezione di progesterone. Nell ambito di una fecondazione in vitro, la risposta delle donne ad una stimolazione con gonadotropine è difficile da predire. Il risultato può essere molto variabile e spaziare da una risposta insoddisfacente ad una risposta eccessiva all ormone, con rischi anche gravi per la salute della paziente. La risposta alla somministrazione delle gonadotropine è influenzata da una serie di fattori, tra cui dei fattori genetici. Il genotipo del recettore dell FSH e dell LH svolge un ruolo importante nel determinare la risposta ovarica ad una stimolazione con l ormone FSH. L analisi del genotipo del recettore dell FSH e dell LH permette di modulare in maniera individuale la somministrazione di FSH e quindi di aumentare l efficacia e la sicurezza della terapia. Il kit FSHR/LHR Screen (Linea MoDiSeq TM) consente la genotipizzazione delle seguenti varianti: Asn680Ser, Thr307Ala e Asp567Asn in FSHR; R554 in LHR. Il kit è basato su una amplificazione in PCR Multiplex, purificazione dell amplificato mediante reazione enzimatica con EXOSAP, reazione di SNaPshot/minisequencing e rivelazione mediante elettroforesi capillare. 2 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

3 METODICA FSHR/LHR Screen CE IVD (Linea MoDiSeq TM ) permette di genotipizzare le seguenti mutazioni: Asn680Ser, Thr307Ala, D567N nel gene FSHR, e R554X nel gene LHR (Tabella 1). Mutazione Gene Variazione Nucleotidica Variazione Aminoacidica Asn680Ser FSHR G-2039 A Asn-680 Ser Thr307Ala FSHR G-919 A Thr-307 Ala D567N FSHR G-1699 A Asp-567 Asn R554X LHR C-1660 T Arg-554 Ter. Tabella 1. Mutazioni identificate dal kit Il kit è basato su una amplificazione in PCR Multiplex, purificazione dell amplificato mediante reazione enzimatica con EXOSAP, e successiva reazione SNaPshot /minisequencing single base extension mediante Kit SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix. La chimica è basata su una reazione di estensione con dideossinucleotidi fluorescenti di un oligonucleotide non marcato complementare al templato contenente il polimorfismo (SNP) d interesse. Ciascun primer si lega al templato complementare in presenza di un ddntp fluorescinato e Taq. La polimerasi estende il primer di un oligonucleotide aggiungendo un singolo ddntp nella posizione 3. I prodotti della reazione di minisequencing vengono successivamente analizzati mediante corsa elettroforetica capillare in sequenziatore automatico, che consente di evidenziare e separare i prodotti di minisequencing come in Figura 1. Figura 1. Profilo elettroforetico di una corsa ottenuta con FSHR/LHR Screen. I picchi elettroforetici relativi agli alleli wild type e mutati di ciascuna delle 4 mutazioni indagate vengono separate per peso molecolare e visualizzate con colori differenti per una chiara e rapida interpretazione dei dati. 3 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

4 Materiale contenuto all interno di ogni kit Il kit da 50 determinazioni è costituito da: N 2 vials contenenti 1X Master Mix: 2 X 580 µl N 1 vial contenente 5U/µl Hot Rescue DNA Polymerase: 1 X 20 µl Dilution buffer: 1 x 1000 µl N 4 vials contenenti SNAP Primer: 4 X 2 µl Materiale necessario ma non fornito Kit di estrazione di DNA umano (es. QiAmp DNA mini kit Qiagen); Exo-Sap USB ABI Prism SNaPshot Multiplex Kit Matrix Standard Set DS-02 Sequenziatore, polimero, Formammide, size standard GeneSccan-120 LIZ; Reagenti di base per sequenziatore automatico; Microcentrifuga da banco ( g. p. m.); Termostato per le provette tipo eppendorf con range di temperatura da 25 a 100 c (solo per alcuni kit di estrazione); Cappa biologica; Puntali dotati di filtro (prevenzione aerosol); Micropipette da 0,5-10 μl; 5-50 μl; μl; μl; Guanti lattice, camice; Provette in polipropilene con tappo da 0,2 ml e da 1,5 ml o 2 ml; Portaprovette; Termociclatore; H 2 0 sterile; Vortex; Conservazione Conservare al riparo dalla luce a -20 C. Ripetuti congelamenti e scongelamenti possono ridurre la sensibilità e devono essere evitati. È consigliato aliquotare i reagenti per usi intermittenti. Avvertenze e precauzioni Tutti i materiali biologici impiegati per l estrazione del DNA devono essere maneggiati come potenzialmente infetti. Si consigliano precauzioni di sicurezza appropriate quando si maneggiano materiali biologici Si raccomanda l utilizzo di un DNA non degradato, con rapporto 260/280 maggiore o uguale a 1,8. 4 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

5 Inoltre si raccomanda di: 1. Indossare guanti monouso durante l uso dei reagenti e dei campioni, lavarsi accuratamente le mani al termine della seduta lavorativa. 2. Utilizzare puntali con filtro e guanti sterili DNA free 3. Non pipettare con la bocca. 4. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici e non maneggiare lenti a contatto nelle aree di lavoro del laboratorio. 5. Non usare il kit dopo la data di scadenza. 6. Non usare le stesse pipette di precisione per l allestimento delle reazioni e il DNA. 7. Scongelare tutti i componenti a temperatura ambiente prima di iniziare un saggio, mixare i componenti e centrifugare brevemente. 8. Eliminare tutti i campioni ed i materiali utilizzati per il test come se potenzialmente in grado di trasmettere infezioni. La loro eliminazione deve avvenire seguendo le normative di legge vigenti. 9. Manipolare all interno di una cappa biologica (in accordo con quanto descritto nella pubblicazione Biosafety Level 2, o linee guida equivalenti) tutti i materiali contenenti o sospettati contenere agenti infettivi. 10. Pulire e disinfettare tutte le superfici di lavoro utilizzando un disinfettante come ad es. l ipoclorito di sodio allo 0,5%, o un altro disinfettante idoneo. 11. Evitare ogni contatto della pelle e delle mucose con i campioni e reagenti del kit. In caso di contatto, lavare abbondantemente con acqua le parti esposte e consultare un medico. 12. Organizzare in modo unidirezionale le fasi operative per l allestimento della reazione e l utilizzo del kit, al fine di prevenire l eventuale contaminazione dei reagenti con prodotti amplificati. È buona norma mantenere separate le aree e le dotazioni dedicate, rispettivamente, alla fase di estrazione dei campioni e di allestimento ed esecuzione delle procedure di amplificazione. Strumentazioni e polimeri da utilizzare Il kit è stato testato utilizzando la seguente strumentazione: Termociclatori Verity Applied Biosystems 2720 Applied Biosystems Personal Biometra Sequenziatori e relativi polimeri: Applied Biosystems ABI 310 POP 4 Applied Biosystems ABI 3500 POP7 5 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

6 L utilizzo del kit con altre strumentazioni ed altri polimeri deve essere accuratamente validato dal laboratorio che esegue il test. Materiale di partenza L utilizzo del kit è stato testato su DNA estratto da sangue periferico. Per ogni analisi, si raccomanda di utilizzare DNA con un rapporto 260 nm vs 280 nm compreso tra 1.8 e 2. Il Procedimento 1. Isolamento DNA Per l isolamento del DNA sono consigliati kit commerciali che consentono di ottenere un DNA di buona qualità e privo di inibitori (es. Blood mini kit QIAGEN). 2. Set up PCR e protocollo termico Preparazione della Master Mix di PCR: - Prima di ogni uso scongelare perferttamente la mix; vortexare per 10 sec. e centrifugare. - Volume finale per reazione: 25 µl. - Prima di ogni uso scongelare perfettamente la mix vortexare per10 secondi e centrifugare. - Allestire la Master Mix in eppendorf separate da 1,5mL e miscelare secondo quanto riportato. 1X Multiplex Mix 5U/ul Hot Rescue DNA polymerase DNA Volume Totale 1 Reazione 22,8 ul 0,2 ul 2uL* 25 ul *È consigliato l utilizzo di 25ng DNA/reazione - Impostare il protocollo termico di PCR sul thermal cycler: Profilo termico PCR 95 C per 10 min 95 C per 1 min 35 cicli 55 C per 1 min 72 C per 1 min 72 C per 10 min 4 C 3. Purificazione dei prodotti di PCR mediante trattamento EXOSAP 6 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

7 Vortexare brevemente i campioni sottoposti allo step di amplificazione, prelevare 5 µl e trasferire in una nuova eppendorf da 0.2 ml. Aggiunger 1 µl di EXOSAP e vortexare per 3 sec. Incubare a 37 C per 45 min e a 80 C per 15 min. Conservare il prodotto a -20 C oppure procedere con lo step 4. N.B.: Mantenere l EXOSAP in ghiaccio durante tutte le operazioni e vortexare qualche secondo prima di prelevare! Ripetuti scongelamenti di questo reagente possono influire sulle performances del prodotto. Per maggiori informazioni su questo reagente. Si consiglia di consultare il product information fornito dalla casa produttrice. 4. SNaPshot Multiplex Ready reaction kit Scongelare e vortexare brevemente la SNAP Mix fornita all interno del ABI PRISM SNaPshot Multiplex kit (Life-Technologies: Cod ). Nel frattempo scongelare anche il reagente SNAP Primer con il relativo buffer fornito nel kit FSHR/LHR Screen. Una volta scongelata la provetta contenente SNAP Primer aggiungere 98 µl di dilution buffer e miscelare per 10 sec. Vortexare brevemente i campioni sottoposti allo step di trattamento con EXOSAP. Allestire la miscela per lo SNaPshot come di seguito riportato: 1 Reazione Snap Mix 2,0 ul SNAP Primer ** 1.0 ul Campione 1,5uL Deionized water 0.5 ul Volume Totale 5 ul ** reagente preparato come sopra descritto N.B. Mantenere SNAP Mix e SNAP primers in ghiaccio ed al riparo dalla luce durante tutte le operazioni. Si consiglia l utilizzo di blocchi refrigerati per lo svolgimento delle operazioni. Una volta allestita la miscela si raccomanda di aggiungere tempestivamente il campione e dare inizio alla reazione! Ripetuti scongelamenti della SNAP Mix potrebbero comportare delle variazioni nel funzionamento. Una volta diluito il reagente SNAP PRIMER come sopra indicato utilizzare entro 3 mesi - Impostare protocollo termico per la reazione SNaPshot sul thermal cycler come indicato dalla casa produttrice: 7 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

8 Profilo termico SNaPshot 25 cicli 96 C per 10 sec 50 C per 5 sec 60 C per 30 sec 5. Caricamento e corsa con iniezione standard NOTA: E possibile apportare modifiche alle condizioni di elettroforesi in base allo strumento utilizzato. Anche i volumi degli amplificati possono essere variabili in base alle caratteristiche dello strumento utilizzato per l analisi. Vortexare e centrifugare i campioni sottoposti a SNaPshot -minisequencing e procedere al caricamento per la corsa elettroforetica su sequenziatore come indicato: Per ogni campione processato: Sequenziatore ABI310 ABI3100 ABI 3500 Formammide 16 ul 16 ul 10 ul 120 LIZ Size Standard 0.5 ul 0.5 ul 0.2 ul Amplificato 0.5 ul 0.5 ul 0.5 ul VF 17 ul 17 ul 10,5 ul Settare i parametri per la corsa elettroforetica Run Module GeneScan E5 Matrix DS-02. A seconda del sequenziatore utilizzato e del relativo polimero, sono riportati i parametri raccomandati per eseguire le corse elettroforetiche. ABI 310 Parametri Injection time Electrophoresis Voltage Collection time EP voltage POP4 3 sec. 10kV 14 min. 15 kv Heat plate temperature 60 C Syringe pump time Preinjection EP 150 sec. 120 sec. 8 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

9 Parametri INTERPRETAZIONE DEI DATI ABI 3500 POP7 Capillary length 50 Oven_Temparature (Gradi) 60 Run_Voltage (KVolts) 10 PreRun_Voltage (KVolts) 15 Injection Voltage (KVolts) 1,6 Run_Time (Secondi) 560 PreRun_Time (Secondi) 180 Injection Time (Secondi) 3 Data Delay (Secondi) 1 Per una corretta interpretazione elettroforetica dei dati, si raccomanda sempre di correre un campione a genotipo noto Altezza dei picchi elettroforetici E preferibile che i picchi non superino il valore di , onde evitare il formarsi di picchi aspecifici in corrispondenza di segnali di intensità eccessiva. Si consiglia pertanto di valutare la combinazione più appropriata di iniezione per il tipo di strumento utilizzato Separazione elettroforetica Nella tabella a seguire vengono mostrate le grandezza in termini di paia di basi (bp) per ognuno degli 8 alleli. Le grandezze elettroforetiche assumono valori differenti considerando diversi polimeri (POP7, POP4) e diversi sequenziatori capillari (ABI 3500,3130,310). Si raccomanda di considerare una intervariabilità di +/- 1 bp per ogni frammento. Allele ABI 3500 POP7 ABI 3130 POP4 ABI 310 POP4 N680S (G-A) Allele G Blue- Wild Type ~30 ~24 ~24 Allele A-Green-Mutato ~31 ~25 ~25 D567N (G-A) Allele G Blue- Wild Type ~33 ~26 ~26 Allele A - Green-Mutato ~32 ~27 ~27 T307A (G-A) Allele G Blue- Wild Type ~38 ~33 ~33 Allele A -Green-Mutato ~39 ~35 ~35 R554X (C-T)R Allele G Blue- Wild Type ~41 ~36 ~36 Allele A - Green-Mutato ~43 ~38 ~38 9 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

10 Separazione eletteroforetica attesa in paia di basi (bp) considerando diversi polimeri (POP7, POP4) e diversi sequenziatori capillari (ABI 3500,3130,310). Rapporto tra i picchi elettroforetici Per una corretta interpretazione dei picchi elettroforetici, e per discriminare un picco aspecifico da un picco reale, si raccomanda di considerare che, in caso di presenza di eterozigote, la ratio tra i due picchi non deve essere mai inferiore a 35%. In casi borderline, si consiglia di ripetere l esperimento con campioni a genotipo noto. LETTERATURA Il grado di risposta alla somministrazione di gonadotropine è uno dei fattori chiave nel successo dei protocolli di stimolazione ovarica controllata nell ambito della fertilizzazione in vitro (FIVET). La letteratura scientifica dimostra che una delle ragioni della variabilità nella risposta da donna a donna risiede nelle differenti varianti alleliche del gene codificante per il recettore FSH. Particolare rilevanza hanno, in tal senso, i polimorfismi in posizione 680 e 307 dell esone 10 del gene FSHR. Per quanto riguarda lo studio dei polimorfismi del gene codificante per il recettore dell LH, la variante allelica R554X (sostituzione arginina con codone di stop), se presente in omozigosi, rappresenta uno dei fattori determinanti della mancata maturazione follicolare. BIBLIOGRAFIA Boudjenah et al., 2012, Plos One Altmae et al., 2011, H Repr Update Yang et al., 2006, Carcinogenesis Greb et al., 2005, J Clin Endocrinol Metab Smits et al., 2003, N Engl J Med Latronico et al., 1996, N Engl J Med Troubleshooting 10 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

11 Se il kit FSHR/LHR Screen sembra non funzionare correttamente in laboratorio, cercare di seguire i consigli ed i suggerimenti nelle tabelle sottostanti. Se il DNA sembra non amplificarsi correttamente, il processo di risoluzione dei problemi dovrebbe concentrarsi sulla la PCR e/o sulle condizioni elettroforetiche. 1. Assenza di picchi di fluorescenza in elettroforesi Possibile causa Azione suggerita D N A Templato di DNA insufficiente o degradato Estrarre nuovamente il campione P C R Errato protocollo di PCR; Errato programma Ricontrollare il protocollo suggerito, seguendo passo per passo la del termociclatore metodica. Eventualmente ripetere il test 2. Picchi di fluorescenza troppo deboli Possibile causa D N A - DNA di scarsa qualità - Presenza di inibitori di PC - Scarsa quantità di templato di DNA Azione suggerita Ricontrollare la metodica di preparazione del campione delle soluzioni, e della loro conservazione Preparare nuovamente il DNA utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test Estrarre nuovamente il campione P C R Protocollo di PCR non corretto -Concentrazione di primers annealed bassa bassa efficienza di annealing ed estensione Injection time non appropriato Controllare il programma nel termociclatore Controllare la calibratura del termociclatore Ricontrollare il protocollo utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test Aumentare la concentrazione dei primers a 1pmol per reazione. Si consiglia di non utilizzare concentrazioni di primers combinati maggiore di 4 pmol in quanto potrebbero causare la incorporazione errata dei ddntp Aumentare injection time 3. Picchi di fluorescenza troppo intensi durante l elettroforesi Possibile causa Azione suggerita D N A Templato di DNA in eccesso Diluire il DNA ed effettuare l amplificazione P C R Utilizzato un programma non corretto Controllare il programma nel termociclatore Controllare la calibratura del termociclatore Ricontrollare il protocollo utilizzando il metodo consigliato ed effettuare nuovamente il test Diminuire la quantità di ExoI Eccessiva quantità di PCR caricata sul sequenziatore Rimozione incompleta di primers PCR Nota: i primers non rimossi possono partecipare all estensione Diluire la PCR ed effettuare nuovamente la corsa elettroforetica Utilizzare ExoSap fresco o metodo di rimozione primers alternativo 4. Picchi di fluorescenza aspecifici Possibile causa Azione suggerita D N A Templato di DNA in eccesso Diluire la quantità di DNA utilizzata per la PCR P C R Eccessiva quantità di PCR caricata sul Diluire la quantità di PCR da caricare nel sequenziatore sequenziatore EXOSAP Trattamento con Exosap non sufficiente Aumentare la quantità di Exosap Allungare il tempo di incubazione da 45 min. a 60 min. a 37 C dopo trattamento con exosap 11 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human

12 Codice prodotto Numero di lotto Data d iscadenza Numero di reazioni Precauzioni Versione Fabbricante Temperatura di conservazione Fabbricante Orga Bio Human S.r.l. Sede Legale Via Helsinki Roma Tel , Fax Sede Operativa Via Amsterdam Roma Tel , Fax Web info@orgabiohuman.it 12 FSHR/LHR Screen Kit Data Sheet- Orga Bio Human