Principali classi di mutazioni

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1 Principali classi di mutazioni

2 Regole per valutare la patogenicità di una mutazione I - Delezioni dell intero gene, mutazioni non senso e anomalie della cornice di lettura molto probabilmente distruggono la funzione del gene e sono quindi patogenetiche. - Mutazioni che cambiano i siti di splicing GT AG che fiancheggiano gli introni molto probabilmente avranno un effetto sullo splicing e quindi solitamente portano ad un abolizione della funzione del gene e quindi alla malattia. Gli effetti dei cambiamenti nucleotidici a carico delle altre regioni introniche sono difficili da predire e dovrebbero essere verificati con tecnologie alternative (ad es RT-PCR).

3 Regole per valutare la patogenicità di una mutazione. II - Una mutazione missenso ha più probabilità di causare una malattia se si trova in una porzione del gene che è funzionalmente importante (Ex DNA binding domain PAX3). - Se cambia un amminoacido che è molto conservato tra specie diverse (ortologhi) o tra membri della stessa famiglia di geni (paraloghi) ci sono più probabilità che la mutazione sia patogenetica.

4 Regole per valutare la patogenicità di una mutazione. III - Le sostituzioni aminoacidiche hanno più probabilità di annullare la funzione di un gene se sono non conservative (sostituzione di una aa polare con uno non polare o viceversa, o di uno acido con uno basico e viceversa). - Un cambio nella sequenza di un gene che è presente per la prima volta in un paziente affetto in una determinata famiglia (de novo) e non è presente nei genitori non malati ha alte probabilità di essere patogenetico.

5 Gli effetti di un allele mutante Come capire se un cambio nella sequenza del DNA e patogenico - se il cambio e stato gia osservato in pazienti affetti dalla stessa malattia - una mutazione de novo assente nei genitori di una persona con una malattia de novo - un nuovo cambio assente in un numero di almeno 100 cromosomi sani - il tipo di cambio - studi funzionali

6 Validazione di un gene candidato ad essere responsabile di una malattia genetica - Analisi di Mutazioni Analisi funzionale di una mutazione Generazione di un modello animale per una malattia genetica

7 Biotecnologie per la diagnosi genetica molecolare ( CGH Malattie cromosomiche (cariotipo, FISH, Altre Malattie geniche ( polymorphisms RFLP (restriction fragment length Southern blotting - DNA Northern blotting - RNA PCR (polymerase chain reaction) amplificazione del DNA SSCP - DGGE DHPLC DNA Sequencing - MICROARRAY (CHIP)

8 ANALISI DEL CARIOTIPO (Piastra metafasica preparata da linfociti umani di sangue periferico) Campione sangue periferico+ fitoemoagglutinina (agglutina globuli rossi e stimola linfociti). Cellule vengono bloccate in mitosi con inibitore microtubuli (es. colchicina). Cellule vengono lisate e e cromosomi metafasici colorati ed esaminati al microscopio.

9 Bandeggio Giemsa o bandeggio G1(G-bands trattamento bland con tripsina seguito da colorazione Giemsa). Bande chiare e scure alternate

10 Sonde (probes) molecolari - Reagenti usati per identificare una sequenza specifica di DNA o RNA in un miscuglio complesso in cui è avvenuta una ibridazione (accoppiamento di basi complementari tra il filamento singolo della sonda ed il filamento singolo bersaglio di DNA o RNA). Le sonde sono comunemente marcate da materiale radioattivo o fluorescente. - Sonde cdna- sequenze di DNA complementare a RNA (originariamente prodotte mediante trascrizione inversa di RNA), in grado di identificare sequenze di esoni (espressi). - Sonde oligonucleotidiche- sequenze di DNA prodotte sinteticamente lunghe nucletidi. - Sonde RNA- RNA marcato in grado di identificare sequenze di DNA o RNA complementari.

11 FISH (Fluorescence In Situ hybridization): A) SONDE CHE VISUALIZZANO SINGOLI CROMOSOMI B) SONDE CHE VISUALIZZANO TUTTI I CROMOSOMI Α C) SONDE CHE VISUALIZZANO SPECIFICHE BANDE CHROMOSOME BARR CODE C Β

12 Chromosome painting probes Piastra metafasica dopo ibridazione con sonde per i 24 differenti cromosomi

13 Analisi cariotipica spettrale Ibridazione In Situ Fluorescente ( FISH ) 24 sonde DNA cromosomaspecifiche, ciascuna marcata con una combinazione differente di 5 fluorocromi

14 Locus-specific probes. Esempio Prader- Willi Diagnosi mediante FISH di una delezione interstiziale nella sindrome di Prader- Willi utilizzando una sonda specifica per la regione critica sul cromosoma 15. Ch 15 centromere ( verde ) Ch 15 PWS critical ( rosso ) region

15 Biotecnologie per la diagnosi genetica molecolare ( polymorphisms RFLP (restriction fragment length Southern blotting - DNA Northern blotting - RNA PCR (polymerase chain reaction) amplificazione del DNA SSCP - DGGE DHPLC DNA Sequencing - MICROARRAY (CHIP)

16 Endonucleasi di restrizione Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici

17 Endonucleasi di restrizione EcoRI non taglierà questa sequenza

18 Mutazioni puntiformi Variazioni nucleotidiche (Mutazioni puntiformi) possono cambiare la sequenza nucleotidica e cambiare quindi il sito di restrizione. EcoRI non è in grado di tagliare le due sequenze mutate.

19 ( DNA ) Southern Blotting

20 Polimorfismi RFLP e Southern Blot Si possono identificare solamente i frammenti di DNA che ibridizzano con la sonda molecolare (probe)

21 Diagnosi molecolare dell anemia falciforme La sonda non ibridizza con il frammento MstII di 0.2 Kb

22 Diagnosi della sindrome da androgeno resistenza per mezzo dell analisi del Southern blot Il DNA dal gel di agarosio è stato trasferito su nitrocellulosa ed ibridizzato alla sonda cdna di un recettore androgenetico. Si osservano 3 frammenti genomici nel DNA di entrambi i genitori ma non in quello del figlio. Conclusione: Il gene per il recettore androgenetico (AR) è X-linked. La madre ha solo un gene AR intatto (l intensità delle bande è simile a quella della padre). Il figlio ha ereditato dalla madre il cromosoma X che ha una delezione nel gene AR.

23 Il Northern blot è una tecnica usata per determinare in quale tessuto o tipo cellulare è espresso un gene, ed anche la lunghezza e la quantità di mrna. I livelli di mrna sono spesso correlati ai livelli di proteina presente nel tessuto.

24 Biotecnologie per la diagnosi genetica molecolare ( polymorphisms RFLP (restriction fragment length Southern blotting - DNA Northern blotting RNA Test di screening PCR (polymerase chain reaction) amplificazione del DNA SSCP - DGGE DHPLC DNA Sequencing - MICROARRAY (CHIP)

25 AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

26 L invenzione della PCR Ideata da Kary Mullis nel 1983 La prima pubblicazione è apparsa nel 1985 Premio Nobel per la chimica nel 1995

27 Polymerase Chain Reaction - PCR La PCR rappresenta la seconda rivoluzione nelle tecniche di manipolazione del DNA. E essenzialmente una tecnica di amplificazione del DNA. DNA ( molecola (singola PCR amplificazione Molte molecole

28 Polymerase Chain Reaction Metodo per l amplificazione esponenziale di sequenze di DNA Ingredienti di base Stampo di DNA o RNA 2 primers complementari a differenti regioni dello stampo DNA polimerasi termostabile 4 nucleotidi il buffer appropriato

29 Applicazioni della PCR ( mutazioni Diagnostica (per la ricerca di Ricerca Genetica forense

30 Thermal cycler, AppliedBiosystems

31 Thermal Cyclers, MJ Research

32 Thermal Cyclers, MJ Research

33 TIPICA MISCELA DI REAZIONE 25 o 50µl in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml) COMPONENTE VOLUME Concentrazione finale 10 X PCR Buffer 5µl 1X 10 X dntps ( 2mM ) 5µl 200µM Forward primer (5 ( pmols/µl 5µl 0.5µM Reverse primer (5 ( pmols/µl 5µl 0.5µM ( 25pmols/50µl ) DNA genomico stampo 2µl 1µg polimerasi termostabile ( 5U/µl ) 0.2µl 1 unità H 2 O (a 50µl di volume ( finale 27.8µl

34 Synthesis by DNA polymerase 5 3 -T A C G T A C G T A -A T G C A T G C A T G C * * Uno specifico DNA a singola elica (primer o innesco) ibrida con l elica che deve essere copiata

35 I cicli della PCR cicli ciascuno comprendente: denaturazione (95 C), sec annealing (50 65 C), sec polimerizzazione (68-72 C), il tempo dipende dalla lunghezza del frammento

36 Quante copie? Nessun prodotto fino al 3 ciclo Dopo 32 cicli ci dovrebbero essere max 1,073,741,764 copie di lunghezza definita (~ )

37 Elettroforesi su gel: visualizzazione diretta delle molecole separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA

38 Elettroforesi su gel : Separa le molecole per dimensione separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA separation verticale --> Acrilamide = DNA, proteine ed RNA Le molecole più piccole migrano nel gel più velocemente.

39 Il DNA colorato con bromuro di etidio emette una fluorescenza di colore rosso-arancio se sottoposto a luce UV.

40 Quanto puo essere grande il prodotto da amplificare? I prodotti di amplificazione sono di solito grandi bp. E possibile amplificare prodotti piu grandi >25 kb. Questo richiede particolari accorgimenti tecnici (buffers, tipi di polimerasi, tempi di estensioni piu lunghi).

41 Quanto è potente la PCR? La PCR può amplificare fino ad ottenere una quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in meno di 2 ore. Lo stampo di DNA non necessita di particolari purificazione se il frammento da amplificare è di dimensioni ridotte (fino a 1000bp). Il prodotto della PCR può essere digerito con enzimi di restrizione, sequenziato o clonato. La PCR può amplificare una singola molecola di DNA (es. uno spermatozoo).

42 Come disegnare i primers per la PCR Devono essere lunghi ~20 basi. Il contenuto G/C dovrebbe essere 45 55%. La temperatura di annealing dei due primers dovrebbe essere paragonabile. Il 3 (parte finale dell oligo) -dovrebbe essere G o C. I primers non devono annilare tra di loro. I primers non devono contenere regioni ripetute.

43 Ottimizzazione della reazione di PCR Temperatura di Annealing dei primers. Concentrazione di Mg 2+ nella reazione. Tempo di estensione. Concentrazione del templato

44 Falsi positivi in PCR Possibili fonti di contaminazione Quando e stato collezionato il campione Durante il trasporto In laboratorio da altri campioni di pazienti o da personale di laboratorio Sarebbe auspicabile un controllo interno Primers non sono abbastanza specifici Migliorare le condizioni di amplificazione Cambiare primers

45 Multiplex PCR Le reazioni di PCR possono essere ingegnerizzate in modo da amplificare simultaneamente frammenti di diversa lunghezza - spesso utilizzato in diagnostica.

46 Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (dhplc) La tecnica si basa sulla differente velocità di eluizione in una colonna cromatografia per gli eteroduplex e gli omoduplex. Questi duplex si formano quando frammenti amplificati di DNA vengono denaturati termicamente e lasciati ricombinare. Una qualsiasi variazione (mutazione o polimorfismo) tra le due forme alleliche di un frammento porta alla formazione di un eteroduplex (combinazione di due catene di DNA a singola catena, non p e r f e t t a m e n t e c o r r i s p o n d e n t i, caratterizzata dalla presenza di una bolla a livello della quale si trova il mismatch). L eteroduplex si comporta cromatograficamente in modo differente sia dall omoduplex non mutato che dall omoduplex mutato: l eteroduplex è solitamente più veloce (meno trattenuto) degli omoduplex e da ciò si può caratterizzare la presenza di una variazione nucleotidica in un campione. La presenza di una mutazione o di un polimorfismo si evidenzia quindi, mediante picchi ulteriori o con un profilo diverso rispetto al wild type.

47 Single Strand Conformation Polymorphism ( SSCP ) Molecole di DNA a singolo filamento migrano in un gel di poliacrilammide non denaturante in maniera dipendente dalla struttura tridimensionale e quindi della loro sequenza.

48 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ( DGGE ) Migrazione elettroforetica su gel di poliacrilammide con gradiente di sostanze denaturanti di frammenti di DNA che rallentano la corsa quando raggiungono una concentrazione di denaturante che corrisponda alla T di fusione. La separazione avviene in base a differenze nella temperatura di fusione delle molecole che è dipendente dalla sequenza nucleotidica. Omoduplex più veloci Denaturazione

49 Sequenziamento del DNA: il metodo di Sanger pozzetti autoradiogramma Sintesi enzimatica di una nuova catena di DNA sullo stampo, usando dntp e didesossi nucleotidi (senza 3 OH) marcati con fluorocromi diversi. L assenza di 3 OH impedisce la formazione di un legame fosfodiesterico con il successivo precursore e quindi all interruzione della sintesi. La concentrazione dei ddntp è 1/100 dei dntp

50 Automated DNA sequencing I frammenti tra loro differiscono per una sola base e separati in base alla loro lunghezza tramite elettroforesi capillare con sequenziatore automatico (rilevatore sistema ottico)

51 DNA CHIPS Il termine di chips di DNA riferisce a campioni miniaturizzati di frammenti di acidi nucleici che sono fissati su supporti di vetro non più grandi di un vetrino da microscopio.

52 DNA CHIPS OLIGONUCLEOTIDI ARRAYS (seq nota, matrice ordinata) TARGET PREPARATION (marcatura con sostanze fluorescenti) HYBRIDISATION SIGNAL DETECTION (scanner per la misura della fluorescenza, la cui intensità è proporzionale al numero di molecole presenti sullo spot)

53 L innovazione tecnologica: il Gene-chip Frammenti di PCR contenenti gli esoni DMD sono spottati in triplicato su ogni array (altosinistra: esoni 1-24, alto destra esoni 25-48, basso-sinistra esoni 49-72, basso-destra esoni Parte superiore = controllo sano. Parte inferiore = paziente DMD con delezione esoni 3-20

54 Analisi di mutazione Qualsiasi sia il test di screening utilizzato SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) o altri il segmento anomalo dovra essere analizzato mediate sequenziamento diretto che confermerà il cambiamento nucleotidico e ne determinerà l esatta natura. Quest analisi può rivelare mutazioni deleterie (codoni di stop), indicando il ruolo patogenetico della mutazione oppure può rivelare mutazioni missenso. Per escludere la possibilità che il cambiamento nucleotidico identificato corrisponda ad un polimorfismo è necessario verificare che la variazione segreghi con la malattia nelle famiglie (in caso di mutazione ereditata) e che non sia presente in una popolazione normale di controllo. La presenza di mutazioni de novo in pazienti è un indicazione piuttosto forte del ruolo causativo nella malattia. In caso di mutazioni missenso è anche utile valutare se il cambio nucleotidico potrebbe essere responsabile di cambiamenti drammatici nella struttura della proteina (cambiamenti amminoacidici non conservativi) o anche se gli aminoacidi soggetti a mutazioni sono molto conservati durante l evoluzione.