Diagnostica e. classificazione dell'epn. Le malattie complemento mediate: EMOGLOBINURIA PAROSSISTICA NOTTURNA. Dott.

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1 Le malattie complemento mediate: EMOGLOBINURIA PAROSSISTICA NOTTURNA Diagnostica e classificazione dell'epn Dott.ssa Lorella Lanza Laboratorio di Diagnostica Citofluorimetria S.C. Anatomia Patologica Ospedale Santa Corona Savona, 6 novembre 2015

2 L analisi citometrica è il test più sensibile ed informativo per l identificazione di un clone caratterizzato dall assenza assenza totale o parziale delle molecole GPI- linked la diagnosi dell EPN

3 Il test citofluorimetrico utilizza anticorpi monoclonali diretti contro proteine GPI-linked o altri reagenti che si legano all'ancora GPI sulla superficie dei globuli rossi o dei globuli bianchi.

4 CD59 CD55 CD58 RBC GPI Linked Proteins in Blood Cells CD59, CD90, CD109 B cells CD48 CD24 CD73 CD55 CD58 CD59 CD108 CD55 CD58 CD59 CD109 CD24 CD66b CD16 CD66c CD87 CD55 CD58 CD59 CD48 CD109 CD157 CD177 Platelets PMN Stem Cell FLAER Monocytes CD14 CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 CD87 CD109 CD157 CD16 T cells NK cells CD48 CD52 CD73 CD55 CD58 CD59 CD87 CD108 CD109 CD48 CD55 CD58 CD59 CD52

5 The International Clinical Cytometry Society (ICCS) Gruppo di studio ClonePnh

6 PANNELLO PER DIAGNOSI EPN I II III IV V VI FLAER CD24 CD14 HLADR CD45 CD15 Vuoto CD59 Vuoto GPA CD45 Vuoto Con questo tipo di combinazioni si possono rilevare cloni molto piccoli (test ad alta sensibilità, 1x10-4 ).

7 FLAER (fluorescently labeled aerolysin) Aerolysin è una proteina batterica che si lega selettivamente all ancora GPI di qualsiasi proteina. FLAER non può essere utilizzato per l analisi sugli eritrociti perchè il reagente non si lega efficacemente ai globuli rossi

8 Cellule EPN non legano FLAER perchè non esprimono GPI e quindi nel test citofluorimetrico un istogramma identifica una distribuzione bimodale del picco di fluorescenza assenza di fluorescenza Cellule negative Presenza di fluorescenza Cellule positive

9 L analisi citofluorimetrica non fornisce solo dato positivo o negativo, ma discrimina popolazioni discrete con differenti gradi di carenza di un antigene e ne determina la percentuale. Non espressione 96,5% bassa espressione 0,5% alta espressione 3%

10 Cellule con completa carenza di proteina GPI-linked sono chiamate EPN III, quelle con parziale carenza sono chiamate EPN II e quelle con normale espressione EPN I. EPN III Totalmente difettive EPN I Cellule normali EPN II Parzialmente difettive CLONE EPN = EPN III + EPN II

11 Cloni EPN2, EPN3 e EPN2-EPN3 EPN3 Cloni nell Archivio Tipo di Clone N % PNH PNH2 + PNH PNH Total labs, 75 active, tests, 529 clones identified

12 Le linee guida della Clinical Cytometry Society (CCS) raccomandano l'uso di SANGUE PERIFERICO per l'analisi citofluorimetrica 3-4 ml di sangue periferico in EDTA (volume maggiore nei casi di spiccata pancitopenia) NO SANGUE MIDOLLARE : ANALISI FUORVIANTE CELLULE ANALIZZATE - Granulociti Neutrofili popolazione che meglio riflette le dimensioni del clone PNH - Eritrociti MA dimensione del clone PNH può essere sottostimata per emotrasfusioni o emolisi intravascolare - Monociti solo test di conferma della presenza del clone - Nessun ruolo dei linfociti

13 Per il test di screening è raccomandata la quantificazione di almeno 2 proteine GPI-linked sulla popolazione di riferimento per escludere la possibilità che la carenza sia dovuta ad un difetto ereditario di una singola proteina. La quantificazione di eventi rari prevede 3 livelli di sensibilità tecnica del test: bassa (limite di sensibilità 1%, ossia una cellula EPN su 100 cellule normali); media (limite di sensibilità 0,1%, ossia una cellula EPN su cellule normali); alta (limite di sensibilità 0,01%, ossia una cellula EPN su cellule normali).

14 Il numero minimo di eventi da acquisire al citometro nel gate specifico, per ciascun livello di sensibilità, è definito dal numero minimo di eventi che consente di individuare un cluster di cellule patologiche (PNH) pari o superiore a 30 (valore che è ritenuto il numero minimo di cellule che definisce un cluster significativo). Risulta ovvio che le sensibilità indicate sono quelle a cui tendere nell analisi: si potrebbe infatti non arrivare alle sensibilità indicate a causa della scarsa cellularità dei campioni, come ad esempio nelle citopenie marcate.

15 Il referto dovrà contenere Sensibilità del metodo descrizione puntuale del difetto delle molecole GPI-linked su granulociti, monociti ed eritrociti, che rappresenta un riferimento indiretto alla clonalità della proliferazione; diagnosi definitiva di PNH, che coincide con la presenza del clone, anche se di ridotte dimensioni (0.01%).

16 Classification of PNH A. Classic PNH B. PNH in the setting of another specified bone marrow disorder (eg, PNH/aplastic anemia or PNH/refractory anemia-mds) C. PNH-subclinical (PNH-sc) in the setting of another specified bone marrow disorder (eg, PNH-sc/aplastic anemia) Differenti livelli di espressione della malattia e quindi diverse dimensioni del clone EPN Parker C, Omine M, Richards S, Nishimura J, Bessler M, Ware R, Hillmen P, Luzzatto L, Young N, Kinoshita T, Rosse W, Socié G; International PNH Interest Group. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood 106(12), (2005)

17 Flow cytometry is recommended to identify the GPI-AP deficient peripheral blood cells that are diagnostic of PNH. Assessment of hemolytic parameters and bone marrow analysis are required to determine the subcategory into which each patient falls Parker C, Omine M, Richards S, Nishimura J, Bessler M, Ware R, Hillmen P, Luzzatto L, Young N, Kinoshita T, Rosse W, Socié G; International PNH Interest Group. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood 106(12), (2005)

18 PNH Classica. Evidenza clinica e biochimica di emolisi intravascolare (reticolocitosi, aumento LDH, e bilirubina indiretta, bassa concentrazione di aptoglobina) Midollo iper- o normo-cellulato con iperplasia eritroide; alterazioni morfologiche lievi o assenti Dimensione del clone usualmente >50%

19 PNH nel contesto di un altra patologia con insufficienza midollare Evidenza clinica e biochimica di emolisi intravascolare (reticolocito aumento LDH, e bilirubina indiretta, bassa concentrazione di aptoglobina) Evidente insufficienza midollare (anemia aplastica, MDS, mielofibrosi). Dimensione del clone usualmente <30%

20 PNH subclinica nel contesto di un altra patologia con insufficienza midollare Nessuna evidenza clinica e biochimica di emolisi intravascolare (reticolocitosi, aumento LDH, e bilirubina indiretta, bassa concentrazione di aptoglobina) Evidente insufficienza midollare (anemia aplastica, anemia refrattaria-mds). Dimensione del clone piccola usualmente <1% (rilevata con test ad alta sensibilità su eritrociti e/o granulociti)

21 Caso clinico Maggio 2012, Uomo 47 aa WBC 4,4/mmc (N 27%-1200/mmc, L 62%-2700/mmc, Mo 11%- 470/mmc), Hb 8,5 gr/dl, PLT 5000/mmc LDH, aptogl, ret 55/1000 BOM: MDS con aplasia/ipoplasia della serie magacariocitaria CFM: L analisi citometrica mostra la presenza di un clone <1% di cellule EPN sulla popolazione di riferimento (granulociti). Tale risultato non è compatibile con una diagnosi di Emoglobinuria Parossistica Notturna florida e va interpretato alla luce del quadro clinico-laboratoristico e midollare del paziente (possibile EPN subclinica associata a disordine midollare, quale anemia aplastica o mielodisplasia). TERAPIA: supporto trasfusionale eritrocitario e piastrinico assenza risposta a immunosoppressivi e stimolanti eritropoiesi TPO mimetico: miglioramento crasi ematica, piastrinopenia persistente senza necessità di supporto trasfusionale

22 EPN su RBC Maggio 2012 Sensibilita 0.01% EPN III 0.1% (245 eventi)

23 EPN su WBC Maggio 2012 Granulociti sensibilita 0.1 EPN III 0.4% (83 eventi) Monociti sensibilita 0.5 EPN III 0.0%

24 Ottobre 2015 Controllo ematologico WBC 5,5/mmc (N 35%-1900/mmc, L 48%-2600/mmc, Mo 15%- 425/mmc), Hb 14,9 gr/dl, PLT 33000/mmc BOM ed aspirato: Displasia trilineare, mielodisplasia con ipoplasia megacariocitaria ed eccesso di blasti (5-9%). CFM: L analisi citometrica mostra incremento del clone di cellule EPN 2,2% sulla popolazione di riferimento (granulociti). PNH subclinica nel contesto di un altro disordine ematologico (classe III di Parker).

25 EPN su RBC Ottobre 2015 Sensibilita 0.01% EPN III 0.1% (245 eventi)

26 EPN su WBC Ottobre 2015 Granulociti sensibilita 0.01% EPN III 2.2% (6547 eventi) Monociti sensibilita 0.05% EPN III 0.0%

27 Progetto multicentrico per la validazione di uno screening citofluorimetrico semplificato di pazienti sottoposti all'indagine per la ricerca dei cloni di Emoglobinuria Parossistica Notturna

28 Studio multicentrico eseguito presso 20 laboratori di citometria del GPMI Ogni responsabile del laboratorio dovrà indicare un clinico (ematologo clinico o internista) di riferimento per l'identificazione dei pazienti che presentano i requisiti clinici per l'inclusione nello studio. Ogni laboratorio dovrà identificare e sottoporre a screening almeno 10 pazienti in 1 anno

29 Criteri di inclusione pazienti che presentano contemporaneamente due criteri clinico laboratoristici per i quali è comunque indicata la ricerca dei cloni EPN Evidenza di emolisi o Trombosi inspiegate (venose/arteriose) + Citopenie o assenza di risposta alla terapia anticoagulante o trombosi in sedi addominali, cerebrali o dermiche Sindromi mielodisplastiche + evidenza di emolisi o ipoplasia midollare o citopenia refrattaria o episodi trombotici Citopenie + evidenza di emolisi o anemia sideropenica refrattaria o non responsive alla terapia Insufficienza renale + evidenza di emolisi

30 Il test oggetto del progetto verrà eseguito adottando una tecnica analitica citofluorimetrica "minimalista" in cui sono impiegati due soli reagenti (FLAER e anti CD15) per l'identificazione dell'eventuale clone sulla sola popolazione di riferimento (i granulociti) impiegando una tecnica analitica a media o alta risoluzione (0,1% o 0,01%). Obiettivi del progetto Validazione del protocollo analitico semplificato per l'esecuzione dello screening citofluorimetrico. Valutazione multicentrica della frequenza di cloni EPN in soggetti ad alto rischio. Vantaggi in termini di tempi di esecuzione del test e di costi

31 GRAZIE PER L ATTENZIONEL

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